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[生物研究] 胶体金免疫层析法检测金黄色葡萄球菌的初步研究

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发表于 2019-12-6 09:23:11 | 显示全部楼层 |阅读模式
葡萄球菌广泛存在于我们生存的环境中.引起食物中毒的葡萄球菌主要是产肠毒素的葡萄球菌.其中以金黄色 葡萄球菌(& hylococcus alzreus,以下简称金葡菌)致病力最强,其能产生多种致病因子,其中金黄色葡萄球菌 肠毒素 (saphylococcus aureusentemtoxlnSE)耐热 100°C O5 h[’。,一般的烹调方法不能将其破坏.通常在进食了有金葡菌及其肠毒素污染的食品.2-4h之内即出现临床 症状。被金葡茵污染的食物极易引起食源性疾病的爆发. 危害严重。因此。建立一种快速、简便的检测方法对及时控 制金黄色葡萄球菌性食物中毒有重要意义。为此.我们制 备了产肠毒素金葡菌的多克隆抗体,进而初步建立免疫胶 体金快速检测金葡菌的实验方法。
1 材料与方法11 材 料111 实验菌株及其培养金葡菌标准株(ATcc25923) 大肠埃希菌标准株(ATCC25922)及铜绿假单胞菌标准 株(ATCC27853)为南方医院检验科芮勇宇博士惠赠:副溶血弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、耶尔森氏菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌小川型、O139型及569B型等菌株均为本室保存各菌 株均用 LB培养基大量培养.收获细菌。
112 实验动物25 kg左右健康雄性新西兰大白兔(可证号:2002—009 2004B024 2004A062),购自南方医科大 学实验动物中心。
113 主要试剂与仪器 羊抗兔HRP—IgG.羊抗兔 IgG自北京鼎国生物技术公司;牛血清白蛋白(GIBCO),其它 试剂均为国产分析纯试剂。ML902定时恒温磁力搅拌器为上海浦江分析仪器厂产品;GL20A全自动高速冷冻离心机为湖南仪器仪表总厂离心机厂产品;318MC型酶标仪为上海三科仪器有限公司产品
12 方 法121 抗血清的制备培养获得金葡菌,平板计数后,参 照文献 制备金葡菌菌体抗原,耳缘静脉注射免疫家兔。 免疫前由耳缘静脉取血 2 ml,分离血清,留作阴性对照。每次注射的金葡菌浓度均为 1×10mcfuml。第一、二次注射10 ml/只,第三、四次 15 ml/只,每次间隔4d。末次注射后 第 7天,耳缘静脉采血,用试管凝集法检测。当效价达1 160013200时,颈动脉放血,分离血清。分装冻存于一2Occ4 122 抗血清的纯化 间接ELISA法测定抗血清效价达 180000—1160000,该抗血清与副溶血弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌 0139型、耶尔森氏菌、大肠杆菌标准株(ATCC25922)、铜绿假单胞菌标准株(ATCC27853)、霍乱弧菌小川型及 569B型经间接 ELISA检测发现,与后5 种菌有交叉反应,采用吸收封闭法,再用饱和硫酸铵分级 沉淀法予以纯化_
123 胶体金颗粒的制备应用柠檬酸三钠还原法。 1%氯金酸溶液1 mI.加99 ml三蒸水煮沸,加 1%柠檬 酸三钠4 ml(37~C预温),快速一次加入,继续煮沸至溶液 颜色由蓝变为酒红色为止。制得胶体金颗粒直径约 15 am。冷却后,用02 molLK2CO3 pH 7275,用 045 m滤膜过滤,4~C保存。
124 确定最适蛋白浓度9支试管各加1 ml胶体 金溶液。用 001molLpH72PB将纯化的兔抗金葡菌多 克隆抗体从 15对倍稀释至1640,各取 100Ixl,按顺序加 入上述 8管胶体金溶液中,末管不加抗体,设为空白对照,混匀,5 min后于各试管中加 10%氯化钠100 ,混匀,室温静置 2 h后观察各管颜色变化。含蛋白量不足的管呈现 由红变蓝的聚沉现象.而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管中溶液保持红色不变。使红色保持不变的最低蛋 白含量即为最适蛋白量.在此基础上再增加 20%作为稳定胶体金的蛋白实际用量。
125 免疫胶体金的标记按上述确定的蛋白量取纯 化好的多克隆抗体,在磁力搅拌下缓慢加入 20 ml胶体金 溶液中,室温搅拌 30rain后加入 10 BSA 0-8 ml(终浓度04),室温搅拌5min,再加入 10 PEG 20000 04 ml(终浓度02),室温搅拌5 min。取 1ml胶体金一抗体结 合物溶液及 1 ml未标记胶体金溶液,各加入10%氯化钠1 ml。室温静置 1h,做稳定性检定。合格后,10 000 rmin离心60 min,沉淀溶于 2ml保存液,045 Ixm滤膜过滤后,4~C保存。
126 免疫层析试纸条的制备r7_玻璃纤维膜、硝酸纤维 素膜 (检测带为110稀释的多克隆抗体.质控带为 10 mgml羊抗兔IgG)、吸水垫,依次贴于贴有双面胶的塑料底片上。膜以 1BSA封闭后,以 O02 molL pH74 PBS 4次,干燥后,切成宽04 cm的小条,密封保存于4 备用。
127 胶体金免疫层析法检测步骤将上述试纸条插入 待检样品 100 l中,待试纸条完全浸润后,将其插入洗涤 液中,洗4次,再插入前述按110稀释的胶体金一抗体结 合物溶液 100 中。最终在试纸条上,检测带和质控带均有条带为阳性,仅质控带显色的为阴性,如质控带未出现 条带,则为体系失效 。
2 结 果21 抗体效价殛浓度所获抗血清试管凝集实验检测效价在 12 000左右. 同时用间接ELISA检测效价达1160000,经吸收封闭及 饱和硫酸铵纯化,效价有降低,但仍在180000以上。蛋 白浓度为2167 mgml
22 胶体金标记及试纸条的标记试管观察法确定最适蛋白稳定浓度在 140,实际加入 蛋白浓度为65~gml,此浓度时。标记的胶体金可以保持 稳定。试纸条检测体系中的检测带浓度约为02 mgml,质 控带为10 mgml
23 特异性抗体虽经吸收法封闭.但用此自制的试纸条分别对耶尔森菌、大肠杆菌标准株(ATCC25922)、铜绿假单胞菌标 准株(ATCC27853),霍乱弧菌569B型及小川型进行检测,发现仍与前三者有交叉反应
24 敏感性用无菌 PBS(002molLpH7+4)配制金葡菌悬液,依 上法检测,结果表明其检测下限为 1x10fum
免疫胶体金技术自1971年引入免疫化学之后,作为 一种新方法,因其具有反应迅速,耗时短;操作简单,不需 任何复杂的辅助设备和仪器;所需试剂和样品量很少.样 品不需特殊处理;实验结果能够长期保存:当抗体或抗原 特异性好时,结果的灵敏性和准确性好等显著优点,已广 泛应用于医学检验和诊断等方面
般认为用于胶体金免疫层析试纸条制备时.至少应 有一个抗体是单克隆抗体,因为单克隆抗体具有很好的特 异性,但是相应的用于细菌检测时,单克隆抗体更容易出 现漏检.尤其是对于抗原结构复杂、分型多的细菌。本次实 验制备了兔抗金葡菌多克隆抗体,标记胶体金,自制胶体 金免疫层析试纸条,采用二步法,用于检测金葡菌。虽然与 耶尔森氏菌等三种细菌有一定的交叉反应.特异性欠佳, 但是检测灵敏性较好,可达 1×1 o6 cfuml,与同类实验检测 灵敏性相接近[4。本实验建立的胶体金免疫层析试纸条法简便、快速、可行,特别适合现场应用。相信在今后的实 验中,通过提纯抗原,进一步纯化抗体等方法,可以提高抗体的特异性及检测的灵敏性,从而进一步优化反应体系. 甚至可以将几种食物中毒致病菌相关抗体点于同一膜上.实现一次检测同时得到一组结果[uA2]。这无疑将提高了免疫层析试纸条应用的实用性和广泛性,对常见细菌性食物中毒的初筛具有重要意义。
原文地址:胶体金免疫层析法检测金黄色葡萄球菌的初步研究_用户2354056307_新浪博客


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