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[生物研究资源] 为什么在免疫组化实验中会使用辣根过氧化物酶

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发表于 2019-9-24 10:04:31 | 显示全部楼层 |阅读模式

免疫组化技术是一种在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,借助可见的标记物对抗原抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。其中显色反应是免疫组化实验的最后步骤,也是该实验成败的关键。辣根过氧化物酶是一些免疫组化染色服务中较为为常用的酶,在实验中辣根过氧化物酶与底物孵育时,可以产生一种着色、荧光或发光标记的分子衍生物,以便可以定量。


1、免疫组化的关键环节有哪些


免疫组化的原理是利用抗原与抗体结合后形成免疫复合物,通过化学反应,使标记于免疫复合物上的显色剂,如酶、金属离子、同位素等,显示一定的颜色,并可借助显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色变化,从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞的结构。免疫组化的关键环节包括取材、制备切片、脱蜡与复水、抗原修复、灭活内源性过氧化物酶和生物素、血清封闭、一抗和二抗浓度和孵育时间、显色等,其中显色反应处于最后环节,也是实验成败的关键。美迪西提供免疫组化染色服务,其生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验,通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等,提供一套完整的生物学服务。


显色系统也称为显示系统,由于抗原抗体结合是肉眼看不见的,显色系统的目的就是使这种看不见的反应变为看得见,从而确定抗原的存在及其定位。显色系统由酶、底物加上显色剂组成,最终可在标记位点形成有色分子的终末产物。


2、什么是辣根过氧化物酶


辣根过氧化物酶(HRP)是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18%,广泛分布于植物界,其中辣根中含量高。HRP的比活性高、稳定、分子量小,且纯酶容易制备。而且HRP系统催化的酶促反应第一步是特异的酶催化底物双氧化氢,其余反应是非特异的,可用各种电子供体介导,所以选用不同的电子供体,可使终产物呈不同颜色。HRP普遍用于ELISA、western印迹分析、免疫组化等不同免疫化学实验中用的免疫球蛋白,还能通过几种不同的方法偶联到抗体上,有二硫键介导的戊二醛交联,过碘酸氧化法等。和HRP、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶AP中,HRP是理想的抗体标记酶,它不仅分子量最小、最稳定,而且糖基化是HRP产生更低的非特异性结合。


通常在免疫组化实验中采用辣根过氧化物酶系统时,选择DAB(棕色)和AEC(红色)酶底物,若采用碱性磷酸酶系统则选择BCIP/NBT(蓝紫色),常规免疫组化显色首选的仍然是DAB敏感度高,定位清晰,易于保存。一些免疫组化染色服务公司提供DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒进行分析研究,可以一种借助辣根过氧化物酶(HRP),用于免疫组化显色、原位杂交显色或western印迹分析等膜显色的试剂盒。


二氨基联苯氨(DAB)是辣根过氧化物酶的常用底物,具有敏感度高、定位清晰、易于长期保存。。在辣根过氧化物酶的催化下,DAB会产生棕色沉淀。该棕色沉淀不溶于水和乙醇。因此在DAB显色后,还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。由于在免疫组化染色操作中显色时间的控制是染色成败的关键环节。另外DAB有致癌可能,所以在实验中应尽量减少DAB的污染。


此外在免疫组化染色中选用辣根过氧化物酶检测系统时,需要灭活内源性过氧化物酶。倘若不进行处理的化,组织中的红细胞、粒细胞可能会干扰染色结果的判断。一般可采用0.3%甲醇-过氧化氢或3%过氧化氢溶液处理10min。


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