四物汤的方证结合研究

洗尽铅华

四物汤的方证结合研究
来源：大品种联盟


　　四物汤的方证结合研究


　　高月1通信作者,马增春1,梁乾德1,刘明1,


　　王宇光1,谭洪玲1,肖成荣1,张伯礼2通信作者


　　(1.军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京 100850;2.天津中医药大学 天津 300193)


　　血虚证是中医临床常见证候之一,战伤失血､放化损伤和各种贫血性疾病均归属于血虚证范畴,临床多以补血名方四物汤为基础方加减进行治疗｡迄今,系统研究血虚证发生发展机制的文献报道较少｡在证本质的观察方面,仅以临床研究和动物整体观察为主,未见有分子水平的系统探讨;对血虚证的发生､发展的分子生物学基础,缺乏相关的评价指标｡血虚证动物模型的制作方法多是单一因素造模,缺乏多因素､系统性的研究,难以综合反映临床血虚证的变化特点,更难以进行相关药物的评价,制约了补血类方剂和中药新药的研究与开发｡四物汤是治疗血虚证的首选药,由地黄､当归､白芍和川芎组成,为临床补血､活血､调经之良方｡目前,对四物汤的研究主要集中在整体､细胞水平,对四物汤的作用机理､配伍规律､药效物质基础尚未阐明,更未见涉及分子､细胞､组织､器官和整体多个层面的系统关联性研究｡


　　方剂与证候是中医两个重要的概念｡方剂在病证结合､方证对应､理法方药一致的条件下,通过方剂本身的多组分作用在人体的多个靶点,融拮抗､补充､整合､调节等多种功效而起到治疗作用,是中医治病的主要手段｡证候应定义为在生理或病理状态下一定时间段可被观察到或测量到的外在表现｡证候是一个非线性复杂系统,具有内实外虚､动态时空､多维界面的特征;是一定阶段患者机体状态的综合反应｡将方剂与证候相结合进行研究,架起理法与方药的桥梁,探求方剂与证候间的内在联系与规律｡本文以多学科理论为指导,综合采用现代分析技术,研究放化损伤和综合放血所致血虚证发生､发展的机制和分子基础,确定血虚证的客观评价指标并通过四物汤进行确证,旨在揭示血虚证本质,探讨四物汤的作用机理､配伍规律和物质基础,建立方证结合的方法学研究模式,重构新的有效活性成分组方,为相关药物的研制奠定基础｡


　　一､基于血虚证模型的方证结合研究


　　血虚证的研究从20世纪70年代始至今已有30多年的历史｡在模型的制作方面,经历了由单纯放血､化学损伤､放射损伤､饥饿疗法到综合放血,饮食不节和劳倦,以及放射损伤和化学损伤结合的过程,以使其更符合中医临床血虚证的发病机制｡中医证的动物模型研究关键有两个方面:一为模型本身是否能体现该证的临床意义及其病理生理变化实质,是否能量化?另一为模型本身所体现的病理生理反应本质能否被相对应的代表方剂所逆转,以此验证模型的可靠性及实用性,为同类方剂的现代化研究提供实验基础｡本文系统研究了射线､环磷酰胺和综合放血法致血虚证发生发展的证本质,提供了不同方法建立血虚证模型的客观标准,为全面评价中医血虚证模型的病变规律奠定了理论基础｡


　　1. 3种血虚证模型的建立与特点比较


　　以射线照射､环磷酰胺腹腔注射和综合放血法制作实验性小鼠血虚证,观察了该动物模型与外周血各血液成份､骨髓造血干/祖细胞､骨髓细胞凋亡､CD34+细胞的改变､细胞周期等影响｡3种血虚小鼠基本体征均表现精神萎靡,神疲乏力,行动迟缓,团缩弓腰,口唇､眼睑､耳廓苍白,毛蓬竖､少光泽等血虚证的临床症状｡


　　3种血虚小鼠外周血中的主要血液成分下降,骨髓造血干/祖细胞的集落生成能力降低,骨髓细胞凋亡增多,骨髓中CD34+细胞减少,细胞周期紊乱｡但从血虚证发生发展的过程来看,3种血虚证小鼠又存在不同特点｡


　　从外周血象来看,60Coγ射线照射建立的血虚证模型白细胞降低明显,红细胞和血红蛋白变化不明显;环磷酰胺注射建立的血虚证模型白细胞和红细胞降低明显;综合放血法建立的血虚证模型红细胞和血红蛋白降低明显｡


　　骨髓中CD34+细胞的比例,可反映骨髓中造血干/祖细胞的数量,射线照射致血虚证小鼠骨髓中CD34+细胞自造模后至第14d均显著低于正常组;环磷酰胺致血虚证小鼠从造模后先升高后降低,分别在第3d,10d达到最高值和最低值｡综合放血致血虚证小鼠CD34+细胞在第8,11d显著高于正常组｡


　　射线照射致血虚证小鼠骨髓细胞凋亡以24h以内最为明显,随后凋亡细胞逐渐减少,7d左右基本消失;环磷酰胺致血虚证小鼠骨髓细胞凋亡以24h以内最为明显,随后凋亡细胞逐渐减少至48h时已检测不到细胞凋亡的特征性DNA断裂条带｡


　　射线照射､环磷酰胺腹腔注射和综合放血法制作的实验性血虚证小鼠均能使骨髓细胞周期紊乱,但各有其变化特点｡γ射线照射组小鼠骨髓细胞周期变化表现为G2/M期阻滞;环磷酰胺致血虚证小鼠骨髓细胞周期表现为代偿性增殖｡


　　2.四物汤反证血虚证模型的研究


　　在射线照射､环磷酰胺腹腔注射和综合放血法制作实验性小鼠血虚证模型基础上,观察了四物汤对3种血虚证模型小鼠中外周血各血液成份､骨髓造血干/祖细胞､骨髓细胞凋亡､CD34+细胞的改变､细胞周期等影响｡研究发现,四物汤可以改善3种血虚证小鼠的外观体征,模型组均表现精神萎靡,神疲乏力,行动迟缓,团缩弓腰,口唇､眼睑､耳廓苍白,毛蓬竖､少光泽等血虚证的临床症状,而四物汤治疗后有一定好转但不能完全恢复正常｡


　　四物汤对3种血虚证模型的共同作用为:四物汤提前给药可预防骨髓细胞凋亡,四物汤治疗给药可促进骨髓细胞增殖,增加骨髓中CD34+细胞数量,增加外周血中的血细胞｡但从四物汤对3种血虚证模型影响的过程来看,又存在不同特点:


　　射线和环磷酰胺损伤所致血虚证小鼠外周血中的白细胞下降快,四物汤对白细胞的改善作用较明显;综合放血法所致血虚证小鼠外周血中的红细胞和血红蛋白降低明显,四物汤对其有明显的改善作用｡


　　四物汤对综合放血和环磷酰胺所致血虚证小鼠CD34+细胞的影响不大｡而对射线所致血虚证小鼠CD34+细胞的影响明显;同时可以促进射线损伤致血虚证小鼠骨髓细胞G0/1期进入S期,而对综合放血和环磷酰胺所致血虚证小鼠骨髓细胞周期的影响不大;射线､环磷酰胺､综合放血所致血虚证小鼠骨髓细胞的凋亡程度不同,四物汤预防和治疗给药可以明显抑制射线所致血虚证小鼠骨髓细胞的凋亡｡


　　二､基于配伍规律的方证结合研究


　　方证对应是指方剂的功效和方剂内的药味及其配伍关系与其所对应的证之间存在着高度的统一性和针对性,方剂是以证候为依据,根据君､臣､佐､使及七情合和的原则而制定的一种具有针对某种证候的药物集合体｡本文从全方､有效部位､有效成分3个化学层次进行四物汤配伍规律的研究,旨在发现四物汤补血的有效物质基础,并确定四物汤新的有效活性组方｡


　　1.四物汤在饮片层次上的配伍研究


　　以中医理论为指导,系统观察了四物汤及其16个不同配伍组方对放化损伤模型动物外周血象､骨髓干/祖细胞的数量和质量､CD34+细胞表达､细胞周期､细胞凋亡的影响,研究揭示了四物汤全方在拆方中的主导地位,尽管各配伍组方在不同指标上各有特点,如川芎对凋亡的影响,白芍川芎对细胞周期的影响等,四物汤全方的效果均优于各配伍组方｡


　　应用HPLC的分析手段建立了四物汤的指纹图谱｡通过对色谱柱的考察和流动相的选择,优化并确定了四物汤指纹图谱的条件;并与单味药材的指纹图谱进行了对照关联,总结了二者的相关性,归属了部分色谱峰的来源,并就在煎煮过程中药物之间的相互作用作了初步分析｡在四物汤药味合煎的过程中,可显著增加有效成分如芍药苷和阿魏酸等的溶出,降低过高的苯甲酸的含量,从而保证用药的疗效与安全性｡


　　2.四物汤在部位层次上的配伍研究


　　四物汤经水煎､过滤､浓缩后,用醇沉法获得20%醇沉物(部位A)､20~80%醇沉物(部位B)､80%醇沉上清浓缩物(部位C)｡对A､B､C3个部位进行初步活性分析,B､C两部位具有与四物汤相似的防治放化损伤作用,四物汤中多糖成分主要存在于80%醇沉物中,活性实验表明,80%醇沉物显示较强活性｡据此进一步进行部位分离,四物汤水煎液用醇沉法得到20%~40%､40%~60%､60%~80%醇沉物(部位B1､B2､B3),醇沉上清液浓缩去乙醇后依次经乙酸乙酯､正丁醇萃取,回收溶剂得部位C1､C2,剩余的水部分浓缩得部位C3｡20%~80%醇沉物进一步分离后,仅60%~80%醇沉物(B3)能够促进模型小鼠外周血红细胞､白细胞的恢复,但活性较20%~80%醇沉物(B)弱;80%醇沉上清提取物亦显示较强活性,进一步的萃提分离物中,正丁醇萃提物(C2)､剩余水部分(C3)能显著防治放化损伤｡祖细胞集落培养实验结果表明,B､C2､C3部位及芍药苷均显示活性,首次发现芍药苷补血活性｡


　　进一步将果糖､葡萄糖和蔗糖单体按照它们在四物汤中的含量混合,实验表明,糖混合物具有升高模型小鼠外周血白细胞和促进造血祖细胞增殖的作用｡用高效薄层色谱(HPTLC)､高效液相色谱(HPLC)和电喷雾离子化质谱(ESIMS)3种方法对四物汤各药味单独和共同煎煮后,C1､C2､C3部位的化学成分进行了考察｡HPTLC､HPLC和ESIMS图谱综合显示,C2部位主要含有芍药苷､阿魏酸､川芎嗪､芍药内酯苷､β-谷甾醇,C3部位主要有蔗糖､果糖､葡萄糖､腺苷｡


　　3.四物汤在成分层次的配伍研究


　　我们主要采用溶剂法和各种色谱技术对四物汤的化学成分进行了较系统的研究,从其水煎液中共分离得到32个化合物,经化学方法和各种波谱技术鉴定了27个化合物的结构｡综合考察各成分对血虚证动物模型的影响,提出了四物汤促进造血作用的主要物质基础为多糖､芍药苷､阿魏酸､川芎嗪等成分,并首次揭示了芍药苷的促进造血活性,并按正交设计考察多糖､芍药苷､阿魏酸､川芎嗪对骨髓基质细胞增殖的影响,结果发现阿魏酸､川芎嗪､芍药苷､多糖的最佳用药比例为5.298∶2.275∶4.285∶1.472｡研究发现,四物汤的补血作用不仅与其所含的化学成分而且和化学成分比例也存在一定的相关性｡


　　三､基于组学的方证结合研究


　　面对方剂这样一个复杂系统,需要从系统论的角度,从机体应答的多个层面(基因､蛋白､代谢物)考察和揭示方剂作用的途径和机理｡作为系统生物学的重要组成部分,基因组学､蛋白质组学以及代谢组学等“组学”手段的发展为复方作用机制的系统研究提供了崭新的技术平台｡本课题组通过相关系统生物学技术的应用,考察了四物汤作用于血虚证机体后可能出现的基因表达改变､蛋白质水平变化及组织和器官水平上的内源性代谢产物谱的变化,寻找出四物汤对血虚证的治疗作用规律｡


　　1.用基因芯片技术发现四物汤的作用机制


　　四物汤､有效部位､有效成分分别作用于细胞和模型动物后,提取RNA并通过体外转录掺入荧光标记分子,与位于芯片上的探针杂交,通过荧光扫描器及计算机分析,发现差异基因,采用Tclass和Sam-Cluster进行聚类和分类分析,结合功能和基因组学手段､知识筛选出四物汤作用的基因表达图谱｡结果揭示,辐射致血虚证小鼠在照射后2h､6h､12h时,IL-2､IL-4､IL-8R､PDGF-R､IL-18､G-CSF表达下调,而不同剂量的四物汤及提取物作用后,这些因子表达上调,四物汤总提物对骨髓造血正向调控因子的上调作用最明显;在脾脏组织中检测到EPO-R和IL-17表达量增加,IL-17的上调可能使一些免疫系统分泌的因子进入骨髓,促进造血;肾脏是EPO产生的主要场所,四物汤给药后不同时间点EPO和EPOR呈现上调,GM-CSF和IL-17等因子也上调｡由此说明四物汤刺激肾脏产生EPO及相关造血因子;胸腺是机体中枢免疫器官,照射后12h模型组检测到IL-18下调,给药后不同时间IL-18､CSF1､IL-17､IL4R､LIFR等呈现上调,其中LIF-R与配体结合后能够激活JAK-STAT途径,介导LIF的维持造血干细胞和胸腺细胞的存活功能,与IL-6､M-CSF协同作用调节造血干细胞的生长分化,间接促进造血｡


　　四物汤化学成分组合可以促进骨髓基质细胞中GM-CSFR､G-CSFR､IL-13､IL-5､IL-2､TPO､NF-Κb､VEGF等表达上调｡综合体内外实验结果,四物汤促进造血作用可能是通过调节细胞因子,提升正向造血调控因子和免疫因子的表达,抑制负向调控因子表达,促进造血调控相关的信号转导因子分泌,而达到对造血调控网络的整体调节和影响｡


　　2.四物汤作用的蛋白质组学研究


　　将四物汤､有效部位､有效成分作用前后的蛋白质分别进行不同荧光标记后,进行等电聚焦和SDS电泳,用扫描仪进行扫描分析｡扫描结果存入数据库并采用专用蛋白质组学分析软件进行分析比较,确定特异表达蛋白质并分析其结构和功能｡通过比较放化损伤引起小鼠骨髓细胞蛋白质组的改变发现,射线和化学诱导剂均可使小鼠骨髓细胞多种蛋白质的表达发生变化,放射主要通过抑制造血生长因子信号转导,影响基因转录与细胞分化,抑制细胞周期和能量代谢等途径抑制造血干/祖细胞的分化｡环磷酰胺则通过破坏细胞分子网络的信号转导,抑制骨髓造血干/祖细胞的迁移,影响其增殖､分化｡四物汤可作用于放化损伤所致血虚证小鼠骨髓的多个靶点,作用于多种蛋白质,在不同程度上逆转放化损伤对小鼠骨髓蛋白质表达的影响｡收集血虚证病人､正常人和服用四物汤病人的血清进行蛋白质组学研究,研究结果表明,血虚证病人血清中造血和免疫功能相关蛋白的平衡破坏,而四物汤可以逆转这些蛋白的改变而恢复平衡｡


　　3.四物汤作用的代谢组学研究


　　我们通过对动物血液或尿液的分析,研究了四物汤､有效部位､有效成分引起的内源性代谢物的变化,得到四物汤作用的特征代谢产物谱,及其随给药进程的动态变化,筛选与四物汤作用机理相关的生物标志物分子｡结果表明正常组､放化损伤所致的血虚证模型组以及四物汤反证组动物的血清代谢物､胸腺､脾脏､骨髓水溶性提取物和脂溶性提取物的核磁共振图谱有明显的不同,主成分分析的结果显示正常组､血虚证模型组以及四物汤反证组能够明显的区分｡进一步找出了对上述区分贡献最大的代谢物,它们主要是血清中的乳酸､肌酸､葡萄糖､胆碱､磷酸胆碱､缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸､低密度脂蛋白､极低密度脂蛋白､不饱和脂肪酸､糖蛋白等;胸腺提取物中的缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸､乳酸､牛磺酸､胆碱､磷酸胆碱､丙三醇､不饱和脂肪酸､低密度脂蛋白､极低密度脂蛋白以及组氨酸等;脾脏提取物中的乳酸､胆碱､磷酸胆碱､牛磺酸､异亮氨酸､长链脂肪酸､丙三醇､不饱和脂肪酸､低密度脂蛋白等;骨髓提取物中的缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸､乳酸､酒精､牛磺酸､葡萄糖､肌酐等｡放､化损伤所致血虚证的可能机制是导致机体脂肪酸β氧化功能紊乱､细胞内外渗透压平衡破坏以及糖酵解功能失调｡经典补血方剂治疗血虚证的机理可能与改善线粒体功能,纠正脂肪酸β氧化功能紊乱;稳定细胞膜,维持细胞内外正常渗透压;调节糖酵解,促进机体正常能量代谢有关｡


　　四､基于计算生物学分析的方证结合研究


　　中药的作用以多成分､多途径､多靶点为特征｡利用现代技术得到的大量信息需要运用计算生物学技术整合､归纳和总结,从而全面反映四物汤与血虚证之间的关系,为四物汤作用机理的系统研究提供全方位的信息｡


　　1.基于博弈论的复方组合成分药效评价


　　将四物汤各种有效成分作为药效协作博弈模型的各参与者,各种有效成分剂量及其组合构成不同组方的策略集(S1,S2,…,Sn),根据各种配伍的药效实验构建组方药效收益函数ui(s1,…,sn),si ⊂ Si,将四物汤组合成分药效评价转化为n个参与者的完全信息静态博弈问题G={S1,…,Sn;ui,…,un),建立成分配伍分析的多方合作博弈模型｡基于该模型分析各种组学特征谱发生变化的原因与有效成分群之间的关系,评价各种成分配伍的全局与局部最优性,得到满足


　　的博弈解,揭示四物汤治疗血虚证的科学内涵｡


　　2.基于粗糙集理论的多水平药效评价


　　粗糙集理论研究不完整数据､不精确知识的表达､归纳,是多粒度､多精度水平的实验结果进行融合分析的方法,特别适合于根据整体､组织､细胞､分子的多水平中药药效实验进行综合药效评价研究｡根据四物汤的多水平多效性药效学评价指标,构建多水平药效评价的粗糙集知识表达系统S:S=,其中U是药效评价集,C为评价条件属性集,D为评价结果属性集,V是属性值构成的集合,f是药效信息函数,指定U中每一个对象的属性值;根据多水平药效评价的粗糙集知识表达系统构建决策表,并根据等价关系R设计信任函数BEL(X)=|R(X)|/|U|和似真度函数PL(X)=|R-(X)|/|U|,从而建立四物汤多层次组合系统评价模型｡以此为基础融合整体､组织､细胞､分子的多水平中药药效实验,评价四物汤的药效特点｡


　　3.基于分子网络的组合靶点药效评价


　　本研究采用血虚证相关基因表达谱对蛋白相互作用网络数据库(HPRD)进行时空裁剪,得到证相关通路和相关蛋白相互作用网络｡在相关分子相互作用网络静态模型的基础上,根据网络中分子功能和相互作用类型,综合采用质量作用方程､米氏方程､Hill方程等数学模型对网络中的分子作用关系进行多精度量化描述,从相关基因表达谱和动态蛋白质组数据中估算模型的参数,最终建立相关分子作用网络的动力学模型｡结合前期在分子水平对四物汤治疗靶标的研究成果,通过定量计算组合靶点干预后网络状态的变化,评估四物汤组合靶点治疗策略的有效性和优越性｡四物汤作用涉及的分子功能包括DNA修复､细胞周期､凋亡､造血､氧化､粘附等,这些分子参与的信号通路有ATM通路,ATR通路,ILK通路,Nrf-2通路,同时四物汤还影响NF-κB,AP-1,p53等转录因子｡


　　4.基于定性因果推理的综合药效评价数学模型


　　采用基于定性因果推理的数学方法对基于博弈的组合成分评价､基于粗糙集理论信任函数的组合系统评价､基于分子网络调控的组合靶点评价进行综合,建立完整的综合药效评价数学模型｡首先根据中药药效评价的领域知识､药效评价体系描述､评价技术和效果构造多源因果关系图;然后针对系统平衡自容结构,不断求解最小完备子集及导出结构,直到没有自容子集;依多源因果关系图及关于系统的中药药效评价知识,对变量行为进行传播,根据过程中的行为序列,对系统行为做出解释;应用多源因果关系图中变量行为的传播以及定性代数方法处理因果关系的冲突,最终构建基于多源因果法的四物汤药理学和药效学评价技术体系,客观完整的评价四物汤的药效和药理作用｡


　　五､四物汤方证结合研究的意义


　　本研究分别采用射线照射､环磷酰胺腹腔注射和综合放血法制作具有中医证候特点的动物模型,发现血虚证的发生发展与外周血各血液成份改变､骨髓造血干/祖细胞的动态变化､骨髓细胞凋亡､CD34+细胞的改变､细胞周期､造血相关基因和蛋白的改变等密切相关｡进而研究四物汤与血虚证之间的方证关系,从全方､有效部分､有效成分3个化学层次和整体､器官､细胞及分子4个药理水平,从方证到理法的逆向辨证探求方剂与证候间的内在联系,基本阐明了补血名方四物汤的药效物质基础,并重构了基于有效成分的新组方(果糖､芍药苷､阿魏酸､川芎嗪),首次发现了果糖和芍药苷的补血活性,研究体现了中医药方证结合研究的特色和优势,为方剂和证候学的结合研究提供了参考模式,对于中药作用机理､物质基础､中药复方配伍规律研究具有重要的指导意义,对中医药研究方法体系和中药新药的研发具有重要的实际意义｡