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[生物技术] 杆状病毒载体表达系统在基因治疗上的应用

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发表于 2018-11-26 09:49:56 | 显示全部楼层 |阅读模式

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随着人们对杆状病毒研究的不断深入,通过病毒基因组改造使其成为杆状病毒载体表达系统,可广泛应用于蛋白生产。由于杆状病毒不会刺激哺乳动物产生强烈的免疫应答,也不会对它们造成功能性的损伤,这些特性使其成为一种极具应用前景的基因治疗载体,给肿瘤治疗、组织再生和靶向给药等民生领域带来福音。
基因治疗是通过exvivo或invivo的方式将功能遗传物质导入细胞从而治疗遗传疾病或后天性疾病的方法,其核心技术之一是获得安全高效的基因转移载体。杆状病毒载体表达是真核细胞系统的一种,因其独特的生物学特性,已经作为一种真核表达载体被广泛应用。美迪西科研人员建立了成熟的杆状病毒-昆虫细胞表达服务平台,提供包括重组杆状病毒制备、重组蛋白及其复合物的表达与纯化服务。
杆状病毒载体表达可以在体外和体内转导哺乳动物细胞并获得目的蛋白的高效表达,因此杆状病毒日益显示了其作为非复制型载体在基因治疗中的应用前景,开辟了杆状病毒应用研究的新领域。
自从首次报道运用杆状病毒介导的P53基因治疗骨肉瘤依赖,已经有许多利用杆状病毒基因转移技术进行心血管、前列腺、肿瘤、神经系统等疾病的治疗研究。另外还发现重组杆状病毒能够在非肝细胞中表达外源DNA,如人宫颈癌细胞系HeLa、人胚肾细胞系293、中国仓鼠卵巢细胞系CHO、叙利亚仓鼠肾细胞系BHK、非洲绿猴肾细胞系CV21等。
1、杆状病毒可以进行稳定细胞系的构建
杆状病毒可以用来获得组成性表达目的基因的细胞系,而且研究者们还发现有一个大于12kb的病毒基因组片段一直存在于固定转化的CHO细胞系的核中。进一步的研究表明,杆状病毒基因组的一些小的不连续片段(5~18kb)通过不规则重组,以单一拷贝元件的形式整合到细胞染色体上。
腺联病毒(AAV)能将自身基因组定点整合到人19号染色体,因此有研究者将一个由哺乳动物启动子调控的表达框,与AAV基因组负责位点特异整合的关键元件连在一起克隆到杆状病毒。利用此杆状病毒,他们克隆到表达框已经整合到19号染色体特异位点的稳定表达细胞系。
2、杆状病毒载体表达系统可用于体外研究
杆状病毒还可用于体外测定新药和抗病毒复合物的效果。如重组杆状病毒系统已成功地用于检测乙型肝炎病毒(HBV)cDNA在HepG2细胞中的表达,并用于测定抗病毒复合物的效果。有研究者首次尝试了将杆状病毒发展成p53缺陷型癌细胞的细胞杀伤载体的可行性,体外实验表明P53与抗肿瘤药物共同作用对癌细胞的杀死率,比P53和抗肿瘤药物各自单独地使用要高。这表明杆状病毒介导的基因转移与化疗的联合方案,为某些肿瘤的治疗提供了一条新的途径。
3、杆状病毒载体表达在构建重组人全长血小板生成素上的应用
将人全长血小板生成素(thrombopoietin,TPO)基因克隆至pBacMam2载体,与BacVector3000病毒DNA共转染昆虫sf9细胞,经筛选后获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒,以此为载体,将人TPO基因导入小鼠体内。结果获得了可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒株,动物实验外周血小板计数升高至正常的2~3倍,RT PCR结果显示TPO在小鼠组织中得到表达。结论:重组rhTPO昆虫病毒是一种有效的基因治疗载体。
4、杆状病毒载体表达系统在体内的研究
有研究者评价了杆状病毒在体内和体外对神经细胞的转导效率,他们直接将带有报告基因的杆状病毒注射进小鼠和大鼠的脑中,一周以后观察到了报告基因的表达,令人惊奇的是杆状病毒并没有被鼠的补体系统所中和。还有研究者将杆状病毒注射到骨骼肌中来检测基因的转移效率,一个假型的VSV2G2杆状病毒载体首次在体外显示能转导肌细胞系,该病毒注射到不同鼠种的后四头肌中,可以检测到报告基因的表达。另外,还发现在某些鼠种中报告基因表达了35~178天,这表明杆状病毒介导长效的基因表达可以在体内得到实现,这将有利于将杆状病毒开发成长期、高效的体内转基因载体。
总之杆状病毒载体表达系统可以作为基因治疗载体在哺乳动物细胞已经得到了证实。杆状病毒通过一种尚未阐明的侵入机制,使其成为一个能对许多哺乳动物细胞系进行高效转移的载体。然而其在体内转导及其机制等需要进一步的研究和解决。

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