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[生物研究] 利用原核表达系统表达乙型肝炎病毒HBX的研究

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发表于 2018-7-31 10:13:10 | 显示全部楼层 |阅读模式

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乙型肝炎病毒简称乙肝病毒,是一种DNA病毒。乙型肝炎病毒感染是引起肝细胞癌HCC的主要原因,但是其导致的肝细胞癌的发生机理仍然不清楚。而HBX一直被怀疑在肝细胞癌的发生中扮演了促进作用,因此有研究者采用了重组HBX蛋白表达纯化方法,来达到进一步解析HBX的结构的目的。获得HBX蛋白为研究其性质和功能,制备各种多克隆和单克隆抗体和直接研究HCC和HBX的关系提供了重要条件。

乙型肝炎病毒调节蛋白(HepatitisB virus X protein,HBx)是HBV基因编码的一种高度保守的蛋白,含有154个氨基酸。文献报道,HBx的转录活性对HBV病毒复制功能起到非常重要的作用,是病毒DNA复制的中心调解器。此外,HBx还参与基因转录、信号转导、细胞凋亡、蛋白质降解等过程,并在HCC的发生和发展过程中发挥重要的作用。

HBX蛋白至今没有晶体结构,这与HBX的表达有直观重要的作用,已有的研究表明HBX蛋白无论是在大肠杆菌中表达还是在杆状病毒中表达,均会以包涵体的形式存在,然后通过变性复性来纯化HBX蛋白。

原核表达系统(大肠杆菌表达系统)是基因表达技术中发展最早,应用最广泛的经典表达系统,近几十年,大肠杆菌表达系统也不断得到发展和完善,被科研及工业用户大量用于各种重组蛋白表达。美迪西提供原核表达服务,该公司建立了成熟的大肠杆菌表达及纯化服务平台,提供包括各种重组蛋白以及其复合物在大肠杆菌中的表达与纯化服务。E .coli 是重要的原核表达体系,在重组基因转化入E.coli 菌株以后,通过温度的控制,诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质,将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。

利用E.Coli原核表达系统对目前己知的基因型A-I的HBX进行非融合表达,建立了一套稳定的、适用于不同基因型的rHBX表达、纯化和复性方法,获得了9种HBV基因型的高纯度重组HBX。并以此为基础,制备了41株Anti-HBX单克隆抗体。通过表位分析、单抗性质鉴定和一系列反应性评估实验,筛选出了适用于蛋白印迹、免疫共沉淀和免疫荧光等功能性检测的高亲和力Anti-HBX单抗。借助Anti-HBX单抗,运用免疫共沉淀方法在转染HBV1.3倍基因组的HepG2细胞中证实HHBX可通过与Bcl-2和Bcl-XL的直接相互作用导致细胞凋亡和坏死。

综上所述,该研究建立的重组HBx蛋白表达纯化方法为进一步解析HBX的结构奠定了重要基础。而目前也有研究表明HBV编码病毒癌蛋白,反式激活蛋白X(HBX),可与肝细胞的蛋白相互作用以促进癌发生

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