药智论坛

查看: 734|回复: 0

[生物技术] 利用昆虫细胞表达系统可表达肠道病毒

[复制链接]
发表于 2018-6-27 09:02:53 | 显示全部楼层 |阅读模式

注册更精彩

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?免费注册

x

肠道病毒71型为手口足病主要病原体,VP1是EV71的结构蛋白,且EV71主要的中和抗原决定簇集中于VP1上,因此研究EV71 VP1蛋白具有重要意义。有研究者利用昆虫细胞表达系统表达肠道病毒71型VP1蛋白并对其进行纯化,研究结果指出,利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达EV71 VP1蛋白。


在EV71感染过程中,VP1蛋白承担者重要的角色,参与吸附、穿入、脱壳等过程,研究表明针对VP1设计的疫苗能保护实验动物,能抑制EV71感染或减轻感染后症状,这为EV71疫苗开发提供了实验和理论依据。



    昆虫细胞-杆状病毒表达系统是目前病毒样颗粒VLPs制备中最常用的表达系统,其代表产品是葛兰素史克公司的二价宫颈癌疫苗。昆虫细胞-杆状病毒表达系统主要是利用bac-to-bac技术将外源蛋白转座进入杆状病毒 bacmid 中,再将该重组病毒转入昆虫细胞中大量表达,最后外源蛋白自发在细胞中装配成VLPs。美迪西建立了杆状病毒-昆虫细胞表达服务平台,提供包括重组杆状病毒制备、重组蛋白及其复合物的表达与纯化服务。


利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达EV71 VP1蛋白,首先要通过化学合成法合成EV71 VP1基因,然后将EV71 VP1基因插入到供体质粒pFast Bac1中,构成重组质粒pFast  Bac1-VP1,再转入JM190感受态细菌扩增,然后提取重组质粒pFast Bac1-VP1转入DH10BacTM感受态细胞,通过转座从而获得重组质粒bacmid-VP1,采用脂质体Cellfectin Reagent将重组质粒bacmid-VP1转染Sf9细胞。通过SDS-PAGE、Western blot法检测目的蛋白的水平,经镍离子亲和层析,纯化VP1蛋白。


  结果显示, SDS-PAGE及Western blot法检测获得蛋白的相对分子质量与预期结果一致,Bradford分析纯化后蛋白的浓度为70μg/ml,纯化度达90%。


昆虫细胞表达系统可以行使蛋白的翻译后修饰功能,对目的蛋白进行糖基化,并且可以使得外源蛋白大量积累,同时不含动物病原体。除此以外,由于杆状病毒基因组巨大,可允许多个外源基因同时插入病毒基因组中进行表达,但是这个表达系统并非完美。首先,昆虫细胞糖基化修饰与哺乳动物细胞不同,后者合成的糖蛋白含有唾液酸末端的杂合型N-糖链;而昆虫细胞表达的蛋白糖链仅包含数个甘露糖或海藻糖等的寡糖类。另外,由于目的蛋白与杆状病毒颗粒共表达,容易产生污染,因此,病毒样颗粒的纯化是使用昆虫-杆状病毒表达系统时尤为值得注意的问题。



您需要登录后才可以回帖 登录 | 免费注册

本版积分规则

QQ|(渝)-经营性-2016-0011|渝B2-20120028|药智论坛 ( 渝ICP备10200070号

渝公网安备 50010802001068号

GMT+8, 2019-8-23 10:42

快速回复 返回顶部 返回列表