药智论坛

查看: 100|回复: 0

[药代动力学] 蛋白质单晶培养方法有哪些 十五种蛋白质单晶培养方法指南

  [复制链接]
发表于 2021-4-7 17:16:58 | 显示全部楼层 |阅读模式
  蛋白质单晶培养方法有哪些 十五种蛋白质单晶培养方法指南
  (1)大量养晶法(bulk crystallization):若急着养出单晶,则将纯化之蛋白质溶液加入固体盐类或饱和盐液,直到溶液中出现乳白混浊色,离心后把上清液(suppernatant)放置数天至数周,有可能养出单晶。
  (2)批次养晶法(batch method):若发现加入蛋白质的沉淀剂和盐类等化学药品,在浓度C1产生沉淀,浓度Cn为液体,则在C1至Cn之间细分成一串浓度 C1>C2>C3>….>Ci>Cn,(n-2)个小试管进行养晶,可能结出单晶。此法之主要缺点在于蛋白质的消耗量大。
  (3)大量透析法(bulk dialysis):把蛋白质溶液包在半透膜(membrane)内,浸入盛有化学药品的器皿中,半透膜能让小分子进出,却不会让蛋白质等大分子通过,则器皿中沉淀剂、盐类和有机溶液等化学药品会穿过半透膜,与蛋白质起作用,直到膜之内外的浓度梯度(concentration gradient)降到零为止。此法的好处在于,器皿中化学药品之浓度可作连续之调整,pH值的范围也可探讨。坏处是膜之内外浓度差异减少时,平衡速率也随之降低。
  (4)微量透析法(microdialysis):把半透膜的体积缩小,绑在比钮扣略大的衬架上,架体之凹槽内注入蛋白质溶液,包覆半透膜的体架放入盛有化学药品的器皿,其养晶原理与大量透析法相同,只是使用蛋白质和化学药品的量放得少。注意凹槽内不得留有气泡,否则膜外的化学药品为气泡所阻止而无法透过气泡,渗入膜内的蛋白质溶液。
  (5)连续萃取(sequential extraction):此法所根据的原理是亚可比(Jacoby)的实验,他发现蛋白质在硫酸铵溶液中溶解度随温度的提升而下降。在4℃以下取得上清液(supernatant),放在室温长晶。先将蛋白质溶液加入固体硫酸铵或饱和硫酸铵液体,使蛋白质溶液沉淀,离心除去上清液。接着保持4℃以下处理一系列的蛋白质沉淀物。准备数种依次递降浓度的沉淀剂(通常为蒸馏水),浓度高的沉淀剂先加入上述蛋白质沉淀物中,以玻棒搅拌并离心,取出上清液,放在室温养晶,再把浓度次高的沉淀剂加入上次未完全溶解的蛋白质沉淀物,搅拌离心,把上清液置于室温养晶,依次类推,直到蛋白质全部溶解为止。这样每次取出的蛋白质浓度依次递减,溶液由低温移至高温,符合亚可比的准则,可能养出蛋白质单晶。
  (6)自由接口间的扩散法(free interface diffusion):若蛋白质在不同的溶剂中具有不同的溶解度,则蛋白质注入盛有沉淀剂试管的上方或下方(依密度而定,密度大者放在下方),在两种溶液的交界面扩散会有晶核长出,装置如图7-10所示。
  (7)凹盘或玻片上的蒸汽扩散法(vapor diffusion on plates or slides)—座滴法:蛋白质养晶的要领在于蛋白质达成过饱和溶液,同时添加的化学药物与蛋白质起作用,协助晶核的形成。掺有化学药品的蛋白质溶液,其水分慢慢扩散,达到过饱和溶液则有可能长出单晶。若蛋白质溶液暴露在空气中,水分蒸发掉,则蛋白质干涸,无法形成单晶,原因是蛋白质单晶约略维持液态的结构,含有大量水分,水分与蛋白质间形成许多氢键,水分蒸发,蛋白质也无以为系,因此必须保持水分,使蛋白质溶液密闭在一个容器中。同时还得调节水分,所以必须置放两种溶液,使蛋白质溶液中的水分扩散到另一种高浓度的溶液中,以达蛋白质溶液的过饱和。
  通常选择适当的盐类和有机溶剂,调在等电点的pH值,形成沉淀剂,把粉晶蛋白质泡成一定浓度,约在5~40mg/ml之间,在凹盘的下凹孔镀硅,注入一些蛋白质溶液和沉淀剂总共10~40 m l。在凹盘外方的塑料盒,倒入20~30ml的沉淀剂。在塑料的四周涂真空油膏(Vacuum grease),加以密封。通常这样的塑料盒对于每种养晶条件制备两盒,一盒放在4℃的低温,另盒放在室温,待其长晶,快则一周,慢则数月,幸运的话,可望长出单晶。通常一次制备数拾条件,大量养晶。要鉴定长出的单晶确实是蛋白质而不是滴入的沉淀剂等化学药品
  若养出蛋白质单晶太小,不足以供X光绕射实验使用,则可使用连续播种法把小晶粒养大:依照养出蛋白质小单晶的条件,炮制母液(蛋白质溶液配合沉淀剂),注入凹孔,外围倒注沉淀剂,加以密封,等待约半天后,打开封盖,把以前所养的小晶粒稍加清洗后放入,企图长大,若长出的晶体仍然不符X光使用,则把最后一次的晶体当新晶种,再继续播种,直到晶体够大。此种养晶法的好处是:用量少,筛选多种条件相当理想;易于修饰塑料盒内沉淀剂的浓度。此种养晶法装置,也可用具有凹槽的玻片来取代,在其一凹孔注入10m l的母液,另一凹孔注入20~40m l的沉淀剂,以小玻片密封,等待长晶。
  (8)悬滴液蒸汽扩散法(vapor diffusion in hanging drops)—悬滴法: 它在原理上和座滴法相同,皆以蒸汽达到平衡,利用少量蛋白质筛选多种养晶条件。此法用量比座滴液更少。在方形或圆形的玻片上镀硅,滴入少于10m l的蛋白质母液,在培养皿的每一凹槽中注入1 ml的沉淀剂,把方形玻片翻转,盖在凹槽孔缘,加以密封,形成悬滴液,进行扩散,蛋白质溶液达到过饱和,长出单晶。
  (9)液体桥连法(liquid bridge)如图7-12(b)所示,一小滴母液和一滴沉淀液分别滴在玻璃片的两靠近处,以细针引导细桥相接,把此载有液滴的玻片放在密封容器中,在细桥相连处可望长出单晶。
  (10)浓度透析法(concentration dialysis):,离子强度弱,则蛋白质溶解度低,易形成晶核,长出单晶,可利用氮气在装有蛋白质和盐类的透析袋内施压,使盐类穿透透析膜流出,降低袋内盐类浓度,使蛋白质溶液在低离子强度下长出单晶。
  (11)pH引导长晶法(crystallization induced by pH):蛋白质的溶解度在等电点的pH值最低,是个良好的养晶条件。有些蛋白质在不同的数个pH值,具有数个溶解度的极小,这些溶解度极小处可望长晶。利用透析法改变透析膜外的pH值是个好办法。也可在蒸汽扩散法中,在外围滴入挥发性酸或碱(如氨水或干冰等)来调节pH值。
  (12)温度长晶法(temperature crystallization):蛋白质溶解度为温度的函数,有些溶解度非常温度敏感。通常温度降低,分子排列较有秩序,引起能趋疲(熵)(entropy)的降低。由液体转变到固体,其熵会降低,反之亦然。井然有序排列的分子易于长晶。通常一种长晶条件泡两份,一份置于室温,另一份放在 4℃的冰箱。
  (13)蒸发(evaporation):这是最原始的方法,为小分子的长晶常用法,也是某些蛋白质常用的养晶法。在蛋白质不变性的条件下,慢慢让母液蒸发,使蛋白质溶液达到过饱和,结出单晶。
  (14)填加有效分子法(effector addition):与有效分子(effector)结合的蛋白质,其溶解度往往与无有效分子结合者差异大,可达到某些构象(conformation)平衡状态的存在,养出此种构象单晶,通常的有效分子有配位体(ligand)和基质(substrate)等。
  (15)对蒸馏水透析法(dialysis against water):离子强度弱则蛋白质溶解度低,以半透膜装母液,外浸蒸馏水,盐类往膜外透出,待膜内蛋白质溶解度降低,可望长出单晶。此法相当有效,值得首次尝试。前提是蛋白质不得变性(denature),有时添加少许 [0.02%(w/v)] 的 Sodium azide,或数滴甲苯(toluene)或氯仿(chloroform)有助防止细菌的滋长,以上信息由医药供应平台药智通整理。

您需要登录后才可以回帖 登录 | 免费注册

本版积分规则

QQ|(渝)-经营性-2016-0011|渝B2-20120028|药智论坛 ( 渝ICP备10200070号

渝公网安备 50010802001068号

GMT+8, 2021-4-15 16:51

快速回复 返回顶部 返回列表