浅析基因工程技术在研究ACE2蛋白功能上的作用

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在新型冠状病毒爆发时，ACE2被鉴定为引起SARS冠状病毒也即2019年新型冠状病毒的基本受体。因细胞受体和病毒蛋白都可以为药物阻断病原体提供了潜在的靶点，ACE2受体可能是疫苗或者药物治疗的另一个潜在靶点。血管紧张素转化酶2(ACE2)的化学本质是一种酶蛋白，基因工程技术如大肠杆菌表达系统的发展使许多微量蛋白得以大量表达，使许多难以制备的蛋白得以表达。利用基因工程技术如大肠杆菌表达系统获得ACE2表达产物对于其功能的研究很重要。而利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功制备Ace2基因敲除小鼠模型,还可以为进一步研究Ace2基因功能奠定基础。

基因工程技术是一项极为复杂的高新生物技术,它利用现代遗传学与分子生物学的理论和方法,按照人类所需,用DNA重组技术对生物基因组的结构和组成进蛋白质或人类有益的生物性状。利用基因工程技术获得足够多的具有生物学活性的ACE2纯化蛋白，对于研究ACE2蛋白的功能具有重要的作用。有研究通过大肠杆菌表达系统得到ACE2纯化蛋白，但其缺陷是没有生物活性，限制了对其生物学功能的研究。

为了获得足够多的具有生物学活性的ACE2蛋白，有研究者构建了pcDNA.3.1（＋）-血管紧张素转化酶2真核表达质粒并检测在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达。CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞系，1957年，美国遗传学家Theodore T. Puck从波士顿癌症研究基金会的George Yerganian博士实验室得到一只雌性中国仓鼠，并分离出原始的CHO细胞。在基因工程疫苗研究的哺乳动物表达载体中，CHO细胞具有极大的代表性，目前已经是生物技术药物最重要的表达或生产系统，成为了基因工程和生物制药的重要工具。

该研究者从羊肾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增出ACE2基因,后将其与pcDNA3.1载体进行连接重组,构建pcDNA3.1（＋）-ACE2真核表达质粒,经HindⅢ、XhoⅠ限制性内切酶双酶切及DNA序列测序分析等方法验证后,通过Lipofectamine 3000脂质体介导转染至CHO细胞,Western blot法检验ACE2基因在蛋白质水平上的表达[1]。该研究者最后成功构建了pcDNA3.1（＋）-ACE2真核表达质粒,并证实其能在CHO中表达,为后续探究ACE2蛋白活性及其作用的研究奠定了基础。

基因克隆表达技术包括大肠杆菌表达系统和哺乳动物表达系统等，已经成为生物学、医学和药物开发研究中的主要技术之一。美迪西生物医药拥有多种蛋白表达系统，包括大肠杆菌表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术。

基因编辑是分子生物学的一种研究技术，可以通过对细胞基因组中目的基因的一段核苷酸序列甚至是单个核苷酸进行替换、切除，增加或者是插入外源的DNA序列，使之产生可遗传的改变。也有研究者在应用CRISPR/Cas9技术高效构建Ace2基因敲除小鼠模型,并繁殖、鉴定及验证Ace2基因敲除小鼠[2]。通过构建靶向敲除Ace2基因的载体,体外将Cas9mRNA和向导RNA （guide RNA, gRNA）显微注射到小鼠受精卵中,通过PCR和TA克隆测序对小鼠Ace2基因的第3至18号外显子删除情况进行检测和鉴定,繁育Ace2基因敲除小鼠并利用qRT-PCR和Western blot方法验证获得的Ace2-/Y小鼠主要脏器中Ace2 mRNA和蛋白表达情况。后来研究者通过使用该方法通过CRISPR/Cas9技术成功制备了Ace2基因敲除小鼠模型,为进一步研究Ace2基因功能奠定了基础。

目前也有研究发现，普通小鼠无法作为新型冠状病毒的药物治疗实验模型，由于老鼠的ACE2和人的ACE2蛋白具有差异性，新型冠状病毒不结合小鼠的ACE2蛋白。而且，早在2007年，研究者发现建立人源ACE2蛋白转基因小鼠模型，在小鼠的肺表达ACE2蛋白，感染人SARS病毒以后，人ACE2蛋白转基因小鼠会死亡。这意味着人源ACE2转基因小鼠可以用来测序抗病毒药物的疗效，显著降低盲试抗病毒药物的临床风险。

[1]真核表达质粒pcDNA.3.1（＋）-ACE2的构建及其在CHO细胞中的表达[J].

[2]应用CRISPR/Cas9技术制备Ace2基因敲除小鼠模型及基因型的鉴定[J].

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