浅析免疫组化假阴性着色的原因

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免疫组化标记因利用抗原抗体结合的原理，而使其具有特异性强，准确性高，可靠性大的特点，可以为病理肿瘤的鉴别诊断、预后判断提供不可或缺的重要依据。对于药物研发来说，一些公司提供的免疫组化染色服务可以服务于生物学检测领域，如诊断异常细胞、研究生物标志物的分布和定位，以及检测蛋白质在生物组织中不同部位差异表达等。然而在免疫组化染色中容易出现假阴性或假阳性的结果，假阴性指的是着色指组织中的抗原应该表达却没有着色。

在抗肿瘤药物的研发中，免疫组织化学可以用于肿瘤诊断及鉴别、预后判断等方面，如用于肿瘤性质的判断、肿瘤分期的确定、细胞属性的判定和对“未分化”的恶性肿瘤的判断。细胞的属性通过免疫组化技术能够利用具有标记出细胞内相应的抗原成分作用的特定抗体来进行判定，从而能够对肿瘤的来源进行准确判定。除此之外，免疫组化技术能够利用细菌、病毒、真菌等特异性的抗体来对各种传染病进行较为准确的诊断。因此免疫组化染色对于医学和生命科学研究至关重要，不少公司提供免疫组化染色服务。免疫组化染色出现假阴性结果的原因主要有以下几点：

1、组织固定

对组织进行固定在免疫组化的主要目的，在于尽可能地确保组织细胞内的抗原性，在实验中通常选择浓度为10%的缓冲福尔马林液作为固定液， 避免蛋白弥散或蛋白降解。组织未及时固定及固定时间不够，固定液错误或浓度差，将影响制片着色，导致假阴性。免疫组织化学技术是根据抗原与抗体特异性结合的原理，检测组织中的肽和蛋白质的一种技术，现常用SP法、SABC法这两种检测方法。美迪西提供免疫组化染色服务，其生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验，通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等，提供一套完整的生物学服务。

2、脱蜡不完全

切片太厚时，可出现假阳性；若切片脱蜡不净或脱蜡后的切片搁置时间过长则可能呈假阴性。石蜡层会干扰甚至抑制抗体与抗原结合，需在二甲苯中彻底脱蜡，二甲苯和酒精应定期更换。

3、修复液不正确

不是所有抗原修复液溶液都适用于所有抗体，当抗原用EDTA修复最佳时，换用柠檬酸修复液有可能造成假阴性结果。

4、抗原热修复温度不够充分

没达到合适温度和规定时间，充分逆转固定可能无法实现。如过修复时间不够、温度较低、溶液pH值不准、切片倾斜致抗体流失、切片干燥或切片周围水分太多，使抗体加入后被稀释则大多导致假阴性。

5、酶修复过度

若组织被过度修复致其形态学破坏，则其抗原可能就不再与抗体结合，从而造成假阴性结果。

6、抗体的质量和浓度

商品化的抗体本身质量欠佳或因运输保管不当及有效期已过，而致抗体失效，往往导致假阴性。抗体在4 ℃冷藏一段时间后效价会降低，并在某个时候会迅速下降以致产生阴性结果。

7、显色剂不相容

标准组合是HRP酶与DAB显色剂组合，核快红显色剂与BCIP/NBT起反应，只用于碱性磷酸酶。

8、步骤错误

如没按正常顺序或时间完成，试剂配制错误，仪器电脑出故障，试剂标签贴错，切片摆放错误等。标记失误，漏加二抗或三抗必然出现假阴性，而加错抗体，则可出现假阳性或假阴性。而且少数组织发生变异或反常表达时，可能发生假阳性或假阴性。

总之免疫组化假阴性或假阳性发生的原因与组织固定、切片质量、染色方法、抗体质量和病理实验研究者的经验等因素有关。目前，免疫组化在临床及病理诊断中已广泛应用，对疾病的判定、鉴别诊断及判定疾病的预后及研究对疾病的治疗药物和方法具有重要的指导意义。进行免疫组化质量控制，对于做好组织病理的诊断对于药物研发至关重要，因此病理研究人员掌握免疫组化的实验技能很有必要。