一种制备糖化白蛋白校准品的新方法

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糖化氨基酸氧化酶(FAOD)比色法是目前测定血清糖化白蛋白(GA)的主要方法¨J。传统的GA校准品采用混合人血清制成，存在被HIV或HPV等污染的风险，血清中共存的葡萄糖还会与白蛋白不断反应生成GA，使GA的浓度产生波动。文献已经报道了将葡萄糖和白蛋白在水相混合、经过7—30d的糖基化反应和2—4d的透析纯化制备GA校准品或质控品的方法，此类制备方法糖化和纯化时间均较长，纯化后的糖化白蛋白溶液中还可能存在少量的糖化多肽和糖化氨基酸，这些物质虽然不参与氯化硝基四氮唑蓝(NBT)比色法的显色反应，但却参与FAOD比色法的显色反应，使GA的测定值与真值之间存在一定偏差。

因此，建立一种糖化时间短、糖化产物中不含糖化多肽、糖化氨基酸、葡萄糖的GA校准品的制备方法，对提高GA检测结果的准确性显得尤为重要。本文在有关文献的基础上“J，建立了在含糖基化加速剂的缓冲液中用葡萄糖将白蛋白快速糖基化、采用切向流过滤方法快速去除糖化多肽等物质的GA校准品制备新方法，具有推广应用价值，报道如下。

l材料和方法1．1实验仪器与材料

切向流过滤系统(美国Spectrum公司)、奥林帕斯2700全自动生化分析仪、电子分析天平(上海天平仪器厂)、pH一3c酸度计(上海雷磁分析仪器厂)；重组人血清白蛋白、葡萄糖、1，2一丙二醇、1，3一丙二醇、1，3一丁二醇、氯化钠、EDTA、叠氮钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均为分析纯；水为去离子水。

1．2实验方法

配制pH值=7．0～8．0磷酸盐缓冲液，其中含有一定量的糖基化加速剂、氯化钠、EDTA、叠氮钠、葡萄糖，加入重组人血清白蛋白，糖基化反应一段时间；将所制备的溶液转移至切向流过滤系统，脱除糖化多肽、糖化氨基酸、葡萄糖；稀释至所需校准品浓度，加入赋形剂，分装后冷冻干燥。

2结果与讨论2．1制备步骤及条件优化

2．1．1白蛋白的快速糖基化

配制含有糖基化加速剂、氯化钠、EDTA、叠氮钠、葡萄糖的pH值=7．0—8．0磷酸盐缓冲液，加入重组人血清白蛋白，在25—37qc反应12—36h。上述步骤中所述pH值=7．0—8．0磷酸盐缓冲液含有的糖化加速剂为1，2一丙二醇、1，3一丙二醇、1，3一丁二醇其中的一种，优选为1，3一丙二醇；所述pH值=7．0—8．0磷酸盐缓冲液浓度为20—200mmol／L，糖化加速剂的浓度为50～150mLJL、氯化钠的浓度为9g／L、EDTA浓度为O．5—5mmol／L、叠氮钠的浓度为0．2—2g／L、葡萄糖的浓度为2O～5OL、重组人血清白蛋白的浓度为2O一50g／L。

2．1．2糖化白蛋白粗溶液的快速纯化

将步骤2．1．1所制备的溶液转移至切向流过滤系统，选择合适的中空纤维膜组件、泵速；进行浓缩操作，在30min内将溶液浓缩到设定的浓缩倍数；进行洗脱操作，在120min内用含有氯化钠、EDTA、叠氮钠的pH值=7．0—8．0磷酸盐缓冲液洗脱至设定的洗脱倍数。上述步骤中所述的中空纤维膜组件由中空纤维膜过滤器和超滤膜组成，超滤膜设置在中空纤维膜过滤器内部，超滤膜为改性聚醚砜膜，截留分子量为60KD；所述的泵速为50—80mL／min；所述的浓缩倍数为3—5倍；所述的pH值=7．0～8．0磷酸盐缓冲液浓度为20—200mmoL／L、氯化钠的浓度为9g／L、EDTA浓度为0．5—5ramol／L、叠氮钠的浓度为0．2—2L；所述的洗脱倍数为10～20倍。

2．1．3纯化后的糖化白蛋白溶液稀释与定值

用HPLC法准确测定步骤2．1．2所制备溶液的糖化白蛋白浓度，用自蛋白稀释液稀释至所需校准品浓度，再次用HPLC法测定糖化白蛋白含量。上述步骤中所述的白蛋白稀释液为含有氯化钠、EDTA、叠氮钠的pH值=7．0—8．0磷酸盐缓冲液，氯化钠的浓度为9L、EDTA浓度为0．5～5mmol／L、叠氮钠的浓度为0．2—2g／L、pH值=7．0—8．0磷酸盐缓冲液的浓度为2O一200mmol／L。

2．1．4纯化后的糖化白蛋白溶液冷冻干燥与再次定值

向步骤2．1．3所稀释好的校准品溶液中加入赋形剂，经1mL／瓶分装、低温预冻、冷冻干燥，制成冻干粉再用去离子水1mL／瓶复溶、HPLC法定值后即可使用。上述步骤中所述的赋形剂为甘露醇、天门冬氨酸钠的组合，甘露醇的浓度为5O～150g／L、天门冬氨酸钠的浓度为1O一30g／L；所述的低温预冻时温度为一50至一80，预冻时间为6—24h；所述的冷冻干燥时冷肼温度为一50~C至一80~C，真空度为≤3OPa，干燥时问为24—72h。

2．2糖化白蛋白校准品制备实施例

步骤(1)，配制含1，3一丙二醇浓度为100ml／L、氯化钠的浓度为9g／L、EDTA浓度为2．5mmol／L、叠氮钠的浓度为1．0L、葡萄糖的浓度为35L的100mmol／LpH值=7．5磷酸盐缓冲液20mL，加入重组人血清白蛋白0．7g使其浓度为35g／L，在30反应24h；

步骤(2)，将步骤(1)所制备的溶液转移至切向流过滤系统，选择截留分子量为60KD的改性聚醚砜膜、泵速为65mL／min；进行浓缩操作，在达到4倍的浓缩倍数时停止浓缩操作；进行洗脱操作，用含有氯化钠的浓度为9g／L、EDTA浓度为2．5mmol／L、叠氮钠的浓度为1．0g／L的100rranol／LpH值=7．5磷酸盐缓冲液进行洗脱，在达到15倍的洗脱倍数时停止洗脱操作；

步骤(3)，用HPLC法测定步骤(2)所制备溶液中的糖化自蛋白含量，浓度为3450p,mol／L，用含氯化钠的浓度为9g／L、EDTA浓度为2．5mmol／L、叠氮钠的浓度为1．0g／L、i00mmol／LpH值=7．5磷酸盐缓冲液稀释11．5倍校准品浓度为300v,mol／L，并用HPLC法准确定值；步骤(4)，向步骤(3)稀释好的校准品中加入甘露醇至浓度为100g／L、天门冬氨酸钠至浓度为2Og／L，1．0mL／瓶分装、一50~C预冻15h；设置冷冻干燥时冷肼温度为一65，真空度为20Pa，干燥时间为48h。

制成冻干粉后随机抽取3瓶，每瓶加1mL去离子水溶解，分别用FAOD比色法和HPLC法重复测定3次，取平均值，FAOD比色法和HPLC法测得校准品的糖化白蛋白浓度为分别为295，294Izmol／L，两者显示了很好的一致性。

2．3本法特征及应用前景分析

本文建立了一种新的糖化白蛋白校准品的制备方法，其基本步骤包括：配制pH值=7．0—8．0磷酸盐缓冲液，其中含有一定量的糖基化加速剂、氯化钠、EDTA、叠氮钠、葡萄糖，加入重组人血清白蛋白，糖基化反应一段时间；将所制备的溶液转移至切向流过滤系统，脱除糖化多肽、糖化氨基酸、葡萄糖；稀释至所需校准品浓度，加入赋形剂，分装后冷冻干燥。按该法制备出的糖化白蛋白校准品，不含糖化多肽、糖化氨基酸、葡萄糖，适合糖化白蛋白校准品的批量生产。

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