浅析糖基化修饰对抗体药物免疫原性的影响

medicilon

抗体药物是一种具有市场潜力的生物技术药物，据一些资料显示2010年全球销量前10位的药物中有4个是单抗类药物，2011年抗体类药物销售额达480亿美元。然而抗体药物在取得良好治疗效果的同时，也可能会引发不同程度的过敏反应和抗抗体反应，即人体对外源免疫球蛋白的免疫反应。进行抗体药物的免疫原性试验，可以考察抗体药物的免疫原性强弱。通过抗体药物的免疫原性试验，并研究糖基化修饰对抗体药物免疫原性的影响，为研发免疫原性低的创新性抗体药物提供科学依据。

抗体药物作为外源性蛋白，不可避免地会激活机体自身的免疫反应，诱导产生抗药物抗体，从而严重影响其安全性和有效性。生物药物的糖基化修饰对其结构和功能均有较大影响，进而影响药物的免疫原性。一方面蛋白质表面的糖链可以诱发特定的免疫反应；另一方面，糖链又可以遮盖蛋白质表面的某些表位从而降低其免疫原性。

抗体药物的免疫原性可以采用抗药抗体（anti-drug antibody， ADA）分析的方法进行。分析技术包括ELISA、ECL、SPR、RIA、MSD等，可灵活采取一种或几种组合，目前常用的技术是ELISA和MSD。试验设计为多步检测法，包括筛选、确证、滴度和中和试验。美迪西生物分析服务部门的服务内容涉及药代动力学、药效学、免疫原性和生物等效性等研究方面，可以为客户提供小分子药物、生物制剂、疫苗和生物标记物的筛选与开发，以及临床前和临床研究。

糖作为生命体重要的物质结构之一广泛地参与了各种生物学功能，其中蛋白糖基化修饰是糖结构的一种重要存在形式。大于50%的哺乳动物蛋白和超过70%的生物蛋白类药物都具有糖基化。糖基化参与了蛋白折叠、跨膜转运、细胞粘附、免疫应答等一系列蛋白功能。单克隆抗体药物的糖基化与药物疗效、药物代谢、药物稳定性与免疫原性等成药性关系密切。糖基化修饰可以促进单抗产品的稳定性和可溶性，并且可以减缓形成聚体的趋势。有研究者将IFN糖基化后，其免疫原性会有所降低。还有研究者对rh-GM-CSF进行糖基化后，也得到了类似的结果，推测可能是糖基侧链遮蔽了生物大分子产生免疫原性的活性位点。

1、糖基化修饰在Rsα、AhcY免疫原性试验上的研究

研究者研究了糖基化修饰对Rsα、AhcY免疫原性的影响，首先通过诱导生产菌BL21表达得到Rsα和AhcY蛋白。经过亲和层析纯化后，Bandscan估算蛋白纯度。利用EDC/NHS化学偶联法对Rsα和AhcY蛋白进行六种甘露糖修饰。BCA法和酚硫酸法分别测定蛋白和糖的摩尔浓度，确定蛋白和糖链反应摩尔比。FITC荧光标记甘露糖修饰蛋白后作用Raw264.7细胞，以荧光显微镜观察吞噬蛋白的速度结合流式细胞术测定被吞噬蛋白的量。收获的糖修饰蛋白混合弗氏佐剂免疫Balb/c小鼠:MTT法测定免疫后第四周的脾淋巴细胞增殖；糖蛋白刺激免疫鼠脾细细胞因子分泌水平测定；间接EILSA法检测小鼠第二周到第八周血清抗体效价。Western Blot检测脾细胞表面TLR2、TLR4受体表达情况。

结果发现六糖修饰的AhcY蛋白被受体识别速度比原蛋白快、免疫原性显著提高。二糖修饰AhcY后蛋白免疫原性显著性提高。五糖修饰Rsα蛋白、四糖修饰的AhcY蛋白受体识别明显加快。

2、糖基化修饰可以降低抗体药物的免疫原性

研究发现，单克隆抗体Fc段CH2结构域含有一个保守的糖基化位点，即Asn-297。Asn-297糖链由核心七糖连接一些末端糖组成，末端糖是高度可变的多糖。Asn-297的糖基化对于抗体结构的稳定和抗体能否达到最佳疗效具有重要的作用。当人源抗体IgG1的Asn-297位点突变为GIn297后，抗体在温度升高时结构不稳定，比较容易形成蛋白多聚体。   西妥昔单抗Fab片段的糖链中α-1-3半乳糖的存在与否与其过敏反应的产生有密切的关系，当利用无α-1-3半乳糖糖基化修饰的细胞系生产西妥昔单抗时，得到的产物免疫原性较低。

单抗药物是当前发展较为迅速的蛋白类药物之一，作为大分子糖蛋白药物，单抗药物的糖基化修饰对其稳定性、有效性和安全性等各方面均有不同程度的影响，因此对其糖基化修饰进行全面表征具有十分重要的意义。药物引起的免疫反应是药物安全性和有效性的重要指标，这也是监管机构、生产企业、临床医生和患者共同关注的。在抗体药物的非临床研究中进行免疫原性试验，并开发可靠的能够有效评估抗药抗体反应的实验方法至关重要。