药品的分析方法验证 如何做？

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药品的分析方法验证 如何做？


作者：小析姐  
来源：实验与分析


　　方法验证在质量控制上有重要的作用和意义，在建立产品质量标准时，分析方法需经验证;在产品生产工艺变更、配方的组分变更、原分析方法进行修订时，则质量标准分析方法也需进行验证。


　　分析方法验证的概念


　　2010 版GMP 规定：“应当采用经过验 证的检方法进行检验，并保持续的证状态。 ”


　　保证药品安全、有效质量可控是药品研发和评价应遵循的基本原则。


　　每一测试项目可选用不同的分析方法，为使测试结果准确、可靠，必须对所采用的分析方法的科学性、准确和可行进行验证。


　　方法验证就是根据确定的检测项目要求，预先设置一定的验证内容，并通过计合理试验来证所采用的分析方法能否符合检测项目要求。


　　指导原则和规要求


　　01、指导原则


　　美国、欧盟、日本、澳大利亚、中国等国家和地区的药品监管机构以及“人用药品注册技术要求国际协调会”(ICH)、世界卫生组织(WHO)、国际标准化组织(ISO)等国际组织都有专门的关于方法学验证的指导原则。另外，美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、日本药局方(JP)和中国药典(ChP)都有专门的附录收载分析方法验证指导原则。


　　02、法规要求


　　ICH在1995年和1996年分别发布了Q2A“分析步骤验证-定义和术语”和Q2B“分析步骤验证-方法学”;ISO17025于2005年发布的“检测和校准实验室通用要求”第“5.4.5”章节中对分析方法验证提出了非常具体的规定和要求。另外，美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、日本药局方(JP)和中国药典(ChP)都有专门的附录收载分析方法验证指导原则。


　　分析方法验证的验证参数

　　不同国家和地区的药品监管机构以及不同国家和地区的药品监管机构以及际组织都有各自的分析方法验证指导原际组织都有各自的分析方法验证指导原则，不同指导原则中要求的验证参数也不同指导原则中要求的验证参数也不尽相同。


　　方法验证的建立


　　方法验证主要由方法建立者进行，方法建立者必须要证明所建立的方法能够满足期望的检测用途。由于大部分药品质量控制方法是由生产企业建立，因此方法学验证的工作大部分是由企业的分析方法研发部门来进行。


　　企业的研发部门在建立质量控制方法时，需要对该方法进行充分的验证。在方法验证的过程中，为了证明方法可行，就要对方法学涉及的相关参数进行验证，具体验证哪些参数和方法的用途有关。


　　分析方法验证的检测项目


　　01、鉴别


　　鉴别的目在于判定被分析物是标化合，而非其它物质，用于鉴别的分析方法要求具有较强的专属性。鉴别方法可分为物理常数测定、化学鉴别方法、光谱鉴别和色法谱鉴别法。


　　例如： 2015 版《中国药典—苯妥英钠的【鉴别】


　　02、杂质检查(限度试验和定量试验)


　　杂质检查主要用于控制主成分以外的杂质。了解药物中杂质的来源，可以有针对性地制定杂质检查项目和检查方法。杂质检查可分为限度试验和定量试验两种情况。


　　例如：2015版《中国药典》—阿司匹林的【检查】


　　03、定量测定(含量测定、溶出度、释放度等)


　　定量测定包括含量测定、制剂的溶出度测定等，由于此类项目对准确性要求较高，故所采用的分析方法要求具有一定的专属性、准确度和线性。常用的含量测定方法包括化学法、仪器法分析法和生物学法。


　　例如：2015版《中国药典》—苯妥英钠的【含量测定】


　　04、其他特定检测项目


　　其他特定检测项目包括粒径分布、旋光度、分子量分布等，由于这些检测项目的要求与鉴别、杂质检查、定量测定等有所不同，对于这些项目的分析方法验证应有不同的要求。


　　分析方法验证的一般原则


　　原则上每个检测项目采用的分析方法，均需要进行验证。


　　方法验证的内容应根据检测项目要求，结合所采用分析特点确定。


　　同一分析方法用于不的检测项目会有验证要求 。


　　例如，采用高效液相色谱法用于制剂的鉴别和杂质定量试验应进行不同要求的方法验证，前者重点要求验证专属性，而后者重点要求验证专属性、准确度、定量限。


　　分析方法验证的具体内容

　　01、专属性


　　鉴别反应


　　鉴别试验应确证被分析物符合其特征。专属性试验要求证明能与可能共存的物质或结构相似化合物区分，需确证含被分析物的供试品呈正反应，而不含被测成分的阴性对照呈负反应，结构相似或组分中的有关化合物也应呈负反应。


　　杂质检查


　　杂质检查应确保可检出被分析物中杂质的含量，在杂质可获得的情况下，可向供试品中加入一定量的杂质，证明杂质与共存物质能得到分离和检出，并具适当的准确度与精密度。否则，通过与另一种已证明合理但分离或检测原理不同、或具较强分辨能力的方法进行结果比较来确定。


　　含量测定


　　含量测定目的是得到供试品中被分析物的含量或效价的准确结果。在杂质可获得的情况下，对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并与未加杂质和辅料的供试品比较测定结果。


　　02、线性


　　线性系指在设计的测定范围内，检测结果与供试品中被分析物的浓度(量)直接呈线性关系的程度。


　　线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量试验和含量测定均需要验证线性。应在设计的测定范围内测定线性关系。


　　03、范围


　　范围系指能够达到一定的准确度、精密度和线性，测试方法适用的试样中被分析物高低限浓度或量的区间。


　　04、
　　准确度


　　准确度系指用该方法测定的结果与真实值或认可的参考值之间接近的程度。有时也称真实度。一定的准确度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证准确度，如含量测定、杂质定量试验。


　　05、精密度


　　精密度系指在规定的测试条件下，同一均质供品经多次取样进行列检测所得结果之间的接近程度(离散) 。精密度一般用偏差、标准或相 对标准偏差表示。用或相时，取样测定次数应至少 6次。


　　06、检测限


　　检测限系指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量。该验证指标的意义在于考察方法是否具备灵敏的检测能力。因此对杂质限度试验，需证明方法具有足够低的检测限，以保证检出需控制的杂质。


　　07、定量限系


　　定量限系指试样中的被分析物能够被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。


　　定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质定量试验，需考察方法的定量限，以保证含量很少的杂质能够被准确测出。


　　08、耐用性系


　　耐用性系指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。


　　耐用性主要考察方法本身对于可变试验因素的抗干扰能力。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则建议在方法中予以写明。


　　09、系统适应性


　　对一些仪器分析方法，在进行方法验证时，有必要将分析设备、电子仪器与实验操作、测试样品等一起当作完整的系统进行评估。


　　对分析方法验证的评价


　　有关方法验证评价的一般考虑


　　01、鉴别


　　用于鉴别的分析方法要求具有较强专属性 , 以证明所采用的分析方法能将可共存的物质或结构相似化合区分。同时，由于一种析方法基被某一特定基团或结构，因此采用种分析方法不太可能完全鉴别被析的目标化合物，故通常采用 2种或 2种以上分 析方法，而且采用不同原理的析方法作为鉴别项，如一种采用化学而另色谱以加强鉴别项目整体的专属性。


　　02、杂质检查——杂质限度检查


　　杂质限度试验一般需要验证专属性和检测限，而对于精密度、线性、定量限等涉及定量测定的项目，则一般不需要进行验证。


　　对于可获得的杂质，如合成中的起始原料、各中间体、聚合物、副产物，均应进行主药与杂质的分离度试验，并且不仅检测主药的最低检测限，也要考察各杂质的最低检测限，以证明在现有的条件下能有效检查杂质。由于部分杂质或降解产物不能直接获得，因此，一般均需进行破坏性试验，在人为设定的剧烈条件下使药物降解，考察主药与降解产物之间的分离度和检测灵敏度，验证所拟定的方法能否有效检出药物在生产、放置、贮存、使用过程中可能产生的杂质。


　　制剂有关物质检查方法验证时，除了应考虑原料药关注的内容，还应关注辅料以及辅料降解产生的降解产物对检测方法可能带来的干扰，因此在进行破坏性试验时，辅料应在相同条件下进行实验，考察辅料的降解。提供空白辅料的实验结果，证明辅料对实验结果无干扰。当辅料对实验结果存在干扰时，应尽量完善方法，以消除辅料的干扰。


　　有关物质检查分析方法通常采用高灵敏度、高精度的高效液相色谱法(HPLC法)。由于薄层色谱法(TLC法)检测灵敏度低,定量精度差,因此TLC法主要用于HPLC法难以检测的有关物质检查中。


　　03、定量测定

　　04、方法验证的整体性和系统性


　　方法验证内容之间相互关联，是一个整体。因此不论从研发角度还是评价角度，方法验证均注重整体性和系统性。


　　例如，对于鉴别项目所需要的专属性，一般一种分析方法不太可能完全鉴别被分析物，此时采用两种或两种以上分析方法可加强鉴别项目的整体专属性。


　　在方法验证内容之间也存在较多的关联性，可以相互补充。如原料药含量测定采用容量分析法时，由于方法本身原因，专属性略差，但假如在杂质检测时采用了专属性较强的色谱法，则一般认为整个检测方法也具有较强的专属性。


　　总之，由于实际情况较复杂，在方法验证过程中，不提倡教条地去进行方法验证。方法如何进行验证需要具体情况具体分析，而不能照搬指导原则。


　　分析方法再验证


　　在某些情况下，如原料药合成工艺改变、制剂处方改变、分析方法发生部分改变等，均有必要对分析方法再次进行全面或部分验证，以保证分析方法可靠，这一过程称为方法再验证。


　　再验证原则：根据改变的程度进行相应的再验证。


　　方法再验证是对分析方法的完善过程，应根据实际改变情况进行再验证，从而保证所采用的分析方法能够控制药品的内在质量。