浅析生物指示剂在制药工艺验证中的应用

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浅析生物指示剂在制药工艺验证中的应用
来源：OurGMP


　　宋文光


　　(北京三元基因药业股份有限公司，北京 102600)


　　摘 要：本文除了介绍《中国药典》(2015版)和中国《药品生产质量管理规范》(2010版)及附录中仅对制药工艺的主要灭菌方法和相应采用的生物指示剂有规定均有规定外，还介绍臭氧对洁净室消毒验证、无菌制剂密封性验证和无菌工艺模拟试验等中采用的生物指示剂。


　　关键词：生物指示剂;灭菌法;密封性验证;无菌工艺模拟试验;制药工艺验证


　　A review of applications of biological indicators in the validation of


　　pharmaceutical proces


　　SongWenGuang YuJunYang WuMeiYing


　　(Beijing Tri-Prime Gene Pharmaceutical Co.，ltd Beijing 102600)


　　Abstract:This review introduced not only the regulations of main sterilization methods and biological indicators of sterilization on the pharmaceutical process described in Chinese Pharmacopoeia (2015 Edition) and the appendix of China "drug production quality management standards" (2010 Edition) , but also the validation of ozone disinfection of clean rooms, validation of sealed pharmaceutical preparation, and biological indicators of aseptic process simulation tests.


　　Key words: Biological indicator; Sterilization method; Seal validation; Aseptic process simulation test; Pharmaceutical process validation


　　0 引言


　　根据USP32<1035>《Biological Indicator For Sterilazation》的概念，生物指示剂(BI)是一类特定微生物经过特定制备方法的生物制品，这些特定微生物比普通的微生物具有更强的耐受性。这些生物指示剂被用于制药工艺中的灭菌设备(如湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌等)的性能确认，气体灭菌法(环氧乙烷、气态过氧化氢等)，过滤除菌法的灭菌程序的验证，在(2015版)《中国药典》和(2010版) 《药品生产质量管理规范》中有详细的要求。但有些重要的制药工艺验证如无菌工艺模拟验证、无菌制剂密封性验证及臭氧对洁净室消毒验证中采用的生物指示剂没有记载。


　　1 常规灭菌方法与其相应生物指示剂


　　1.1 湿热灭菌法与其相应生物指示剂


　　湿热灭菌是将灭菌物品置于灭菌器内利用高压饱和蒸汽或过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质，核酸变性而达到杀灭微生物的方法。湿热灭菌无论采用何种灭菌参数(灭菌温度和时间)，必须确保物品灭菌后的无菌保证水平SAL≤10-6，本灭菌方法采用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilusATCC7953)的被杀灭程度，是评价一个灭菌程序有效性最直观的指标，要求生物指示剂每片(或每瓶)或孢子数为5×105～5×106，达到的物品灭菌后的SAL≤10-6。


　　1.2 干热灭菌法与其相应生物指示剂


　　干热灭菌法是指灭菌物品置于干热灭菌器内、隧道烘箱灭菌箱等干热灭菌设备中，是利用干热空气将整个微生物菌体碳化达到杀灭微生物或除热源质的方法。干热灭菌无论采用何种灭菌参数(灭菌温度和时间)，必须确保物品灭菌后的无菌保证水平SAL≤10-6，本灭菌方法采用的枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis ATCC9372) 的被杀灭程度，是评价一个灭菌程序有效性最直观的指标，要求生物指示剂每片(或每瓶)或孢子数为5×105～5×106，达到的物品灭菌后的SAL≤10-6。干热灭菌采用250℃45min灭菌参数，除确保灭菌物品灭菌后的SAL≤10-6外，还应考虑灭菌后的内毒素至少下降3个对数单位，采用的生物指示剂为大肠杆菌内毒素(Escherichia coli endoxinCMCC(B)44102)，是评价一个灭菌程序有除热源质有效性最直观的指标，要求生物指示剂每瓶含有不小于1000单位的细菌内毒素。达到的物品灭菌后的内毒素至少下降3个对数单位。


　　1.3 辐射灭菌法与其相应生物指示剂


　　本法最常用的是60Co-γ射线辐射灭菌，是将灭菌物品放置于γ射线的电子加速器发生的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法。辐射灭菌法无论采用何种灭菌参数(辐射剂量)，必须确保物品灭菌后的SAL≤10-6，本灭菌方法采用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus pumilus ATCC27142)的被杀灭程度，是评价一个灭菌程序有效性最直观的指标。


　　1.4 过滤除菌法与其相应生物指示剂


　　本法利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理除去液体或气体中的微生物的除菌方法。过滤过程中无菌保证与过滤液体的初始生物负荷及过滤器的对数下降值LRV有关，即表示过滤器的过滤除菌效率，对孔径为0.22微米的过滤器，每1cm2有效过滤面积的LRV≥7。采用的生物指示剂为生物指示剂为缺陷假单胞菌(Pseudomonasdiminuta ATCC19146)。由于在实际过滤除菌中，没有采用LRV法进行验证，所以，在每一次的过滤除菌前后应进行完整性测试，确认滤器在除菌过滤过程中的有效性和完整性。


　　1.5 气体灭菌法


　　是利用化学消毒剂形成的气体杀灭微生物的方法。常用的化学消毒剂有甲醛熏蒸、环氧乙烷、气态过氧化氢、雾化过氧化氢和臭氧(O3)等。我们知道无论采用何种气体灭菌方法，可以采用相应生物指示剂来评价此灭菌方法，气体灭菌法教复杂，我就分别介绍;


　　1.5.1 甲醛熏蒸气体灭菌


　　甲醛熏蒸灭菌由于它的安全性、残留性和腐蚀性存在问题，虽然在2015版《中国药典》还存在，2020版可能被淘汰，但在欧美等国家的药典已经明确规定禁止使用甲醛气体灭菌。所以采用的生物指示剂，本文不再介绍了。


　　1.5.2 环氧乙烷气体灭菌


　　采用的同干热灭菌的生物指示剂枯草芽孢杆菌孢子(ATCC9372)。


　　1.5.3 气态过氧化氢灭菌


　　采用的同湿热灭菌的生物指示剂嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(ATCC7953)。


　　2 雾化过氧化氢对洁净区灭菌与其相应生物指示剂


　　雾化过氧化氢的灭菌方法，是利用过氧化氢雾化发生器，通过压缩空气，将液态过氧化氢消毒剂形成雾化的小于10微米的达到亚微米的过氧化氢颗粒，可以快速高效杀灭微生物，常用于制药的行业的洁净区的消毒，如A级隔离系统，B/C/D洁净区的微生物消毒。也可以用于过氧化氢传递窗等。


　　雾化过氧化氢无论采用何种灭菌参数(过氧化氢浓度和时间)，采用的生物指示剂2015版《中国药典》没有记载，但USP规定采用的同气态过氧化氢灭菌的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的(ATCC12980，不是ATCC7953)。


　　3 臭氧(O3)气体灭菌


　　臭氧(O3)灭菌是常用古老又崭新的的气体灭菌法，臭氧发生器通过高压放电的原理产生O3，使微生物发生抑菌、灭菌和溶菌而达到杀灭微生物的方法，是属于生物化学反应。常用于制药的行业的臭氧灭菌器对物品的灭菌和洁净区的微生物消毒。


　　3.1 臭氧对物品气体灭菌法验证


　　采用灭菌参数(臭氧浓度不低于50g/m3;灭菌时间40min)，采用的同干热灭菌的生物指示剂枯草芽孢杆菌孢子(ATCC9372),达到的物品灭菌后的SAL≤10-6。


　　3.2 臭氧对洁净室气体灭菌法验证


　　臭氧对洁净室灭菌，是利用空调机组的净化系统的作为载体，将臭氧发生器产生的臭氧，通过送风到整个洁净室，并使臭氧浓度分布到整个洁净室，按照消毒技术规范的要求，当臭氧浓度达到20mg/m3,作用30min,对洁净室的微生物的杀菌率达到95%以上，因此监测臭氧浓度和维持相应浓度的时间。根据经验在空调机组的回风段，安装臭氧浓度监测仪并时时进行监测，显的非常必要。由于臭氧(O3)本身分解较快，不同于氧对物品气体灭菌在密闭的设备内，在洁净室内分解成氧气很快，很难达到杀灭孢子的效果，因此不能采用臭氧对物品气体灭菌法验证同枯草芽孢杆菌孢子(ATCC9372),作为生物指示剂达到的物品灭菌后的SAL≤10-6。对臭氧对洁净室气体灭菌无论采用何种的生物指示剂2015版《中国药典》和当前USP均没有记载。参考消毒技术规范和经验推荐金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC(B)44112)革兰氏阳性菌阳性和大肠杆菌(Escherichia coli CMCC(B)44113)革兰氏阴性菌为生物指示剂，来评价一个灭菌程序有效性最直观的指标，要求生物指示剂每个TSA平皿的活菌数在灭菌前在150～200之间，经臭氧灭菌后杀菌率达到95%以上，符合要求。除用上述生物指示剂之外，还应考虑分离出环境监测和无菌检查中发现的典型微生物，作为臭氧对洁净室气体灭菌法验证的生物指示剂。


　　4 无菌制剂密封性验证与其相应生物指示剂


　　2010版《药品生产质量管理规范》附录1无菌药品对无菌制剂密封性验证有明确要求。本文介绍的是微生物侵入法进行密封性验证。生物指示剂采用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa CMCC(B)10104)，在正常的生产工艺中往一定数量的输液瓶、西林瓶或安培瓶等灌注TSB培养基来代替药液，经压塞，轧盖后，30～35℃培养14后，灯检，确认样品没有染菌。然后将样品完全进入浸入高浓度的铜绿假单胞菌菌液中，30～35℃再培养14后，清洗好样品，再进行灯检，确认样品的污染情况。


　　5 无菌工艺模拟试验与其相应生物指示剂


　　无菌模拟试验是通过模拟无菌生产工艺全过程，来证实生产过程中无菌保障措施的有效性。为了保证此项试验的有效性，对模拟试验采用的TSB培养基进行促生长能力试验和阳性对照是非常重要的。


　　5.1 TSB培养基促生长能力试验与相应生物指示剂


　　应在无菌工艺模拟试验前及14天培养后按照《中国药典》(2015版)方法对TSB培养基进行促生长能力试验。采用的生物指示剂(菌种)包括：白色念珠菌(Candida albicans CMCC(F)98001)、枯草杆菌(Bacillus subtilis CMCC(B)63501)、黑曲霉(Aspergillus nigerCMCC(F)98003)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC(B)26003)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes CMCC(B)64941)。


　　除上述五种生物指示剂外，同臭氧对洁净室气体灭菌实际中还应考虑加入环境监测和无菌检查中发现的典型微生物。此试验接种微生物数≦100CFU/输液瓶、西林瓶或安培瓶等。以证明培养基能够支持微生物的生长。


　　5.2 TSB培养基阳性试验与相应生物指示剂


　　应在无菌工艺模拟试验后按照《中国药典》(2015版)方法对TSB培养基进行阳性试验。采用的生物指示剂(菌种)包括：白色念珠菌(Candida albicans CMCC(F)98001)、枯草杆菌(Bacillus subtilis CMCC(B)63501。


　　除上述两种生物指示剂外，同培养基促生长能力试验，还应考虑加入环境监测和无菌检查中发现的典型微生物。此试验接种微生物数≦100CFU/输液瓶、西林瓶或安培瓶等。在20～25℃培养7天进一步证明培养基能够支持微生物的生长能力。


　　6 常用的生物指示剂在验证中的应用

序号	生物指示剂名称	编号	用途
1	嗜热脂肪芽孢杆菌孢子 Spores of  Bacillus stearothermophilus	ATCC7953	湿热灭菌法验证和 气态过氧化氢验证
2	枯草芽孢杆菌孢子 Spores of Bacillus subtilis	ATCC9372	干热灭菌法验证 环氧乙烷气体灭菌法验证 臭氧对物品气体灭菌法验证
3	短小芽孢杆菌孢子 Spores of Bacillus pumilus	ATCC27142	60Co-γ射线辐射灭菌法验证
4	缺陷假单胞菌 Pseudomonasdiminuta	ATCC19146	过滤除菌法验证
5	嗜热脂肪芽孢杆菌孢子 Spores of Bacillus subtilis	ATCC12980	雾化过氧化氢验证
6	金黄色葡萄球菌 Staphylococcus  aureus	CMCC(B)44112	臭氧对洁净室气体灭菌法验证
7	大肠杆菌 Escherichia coli	CMCC(B)44113
6	铜绿假单胞菌 Pseudomonas  aeruginosa	CMCC(B)10104	无菌制剂密封性验证 无菌工艺模拟试验
7	白色念珠菌 Candida albicans	CMCC(F)98001	无菌工艺模拟试验
8	枯草杆菌 Bacillus subtilis	CMCC(B)63501
9	黑曲霉 Aspergillus niger	CMCC(F)98003
10	金黄色葡萄球菌 Staphylococcus  aureus	CMCC(B)26003
11	生孢梭菌 Clostridium sporogenes	CMCC(B)64941
12	大肠杆菌内毒素 Escherichia coli endoxin	CMCC(B)44102	干热灭菌法验证

　　7 术语


　　(1) (F) ：表示是生物指示剂是霉菌;(B)：表示是生物指示剂是细菌


　　(2)CMCC : 中国医学细菌保藏管理中心


　　(3)ATCC : 美国标准菌种保藏管理中心


　　(4)SAL ：无菌保证水平


　　(5)CFU :细菌菌落数


　　(6)TSB ：胰蛋白胨大豆液体培养基


　　8 结语


　　(1) 在制药工艺中的不同的验证方法，应选择与其相适应的生物指示剂，这样验证结果才可靠。常规灭菌方法与其相应生物指示剂在《中国药典》(2015版)可以查到;雾化过氧化氢对洁净区灭菌与其相应生物指示剂在2015版《中国药典》没有记载，但USP可以查到;臭氧对洁净室气体灭菌法选用的生物指示剂是参考消毒技术规范和实际工作总结的，仅供参考;无菌制剂密封性验证和无菌工艺模拟试验与其相应生物指示剂，是参考其他文献，仅供参考。


　　(2) 生物指示剂属于特出的标准品，有商品化的，如自己制备，注意以下情况:应在一定的程序下进行，制备前，必须了解微生物的特性，标准菌株应在适宜的培养基中培养，培养物中孢子的数量尽量多，生物指示剂中都含有一定数量的孢子，这些孢子必须附着在滤纸片、沙土、无锈钢片等惰性材料的载体上，并配有相应的培养基，这样验证结果才可靠。


　　(3) 每项制药工艺验证中选用的生物指示剂，在培养过程中，均应进行阳性对照和阴性对照试验。


　　(4)两种不同的过氧化氢气体灭菌采用的生物指示剂，都是嗜热脂肪芽孢杆菌孢子，但编号不一样，雾化过氧化氢气体灭菌ATCC12980，不是气态过氧化氢灭菌采用ATCC7953。


　　[参考文献]


　　[1] 中国《药品生产质量管理规范》(2010版)及附录


　　[2]中国药典委员会，中华人民共和国药典(2015版)[M]，北京：中国医药科技出版社，2015.


　　[3]顾维军，徐禾丰，等，制药工艺的验证[M]，北京：中国质检出版社，2012.


　　[4]何国强，陈跃武，马义岭，等，制药工艺验证实施手册[M]，北京：化工出版社，2012.


　　[5]中国医学出版社管理中心，中国医学细菌菌种目录(1993版)[M]，北京：北京理文印刷厂出版社，1993.


　　[6]USP32<1035>《Biological Indicator For Sterilazation》


　　[7]PDA technical Report No.28 Revised Process Simulation Testing for Sterile Bulk Pharmaceutical Chemicals;