不同药物对卵巢癌Caov-3细胞的迁移和侵袭能力的研究

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细胞迁移生正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。细胞迁移实验服务包括细胞划痕法、实时细胞追踪、Traswell和细胞芯片等。癌症的形成与肿瘤细胞的迁移能力密不可分，这也成为了一个诊断和治疗癌症的一个靶点，因此进行药物对肿瘤细胞的迁移和侵袭能力的实验研究，为寻找药物的作用机制提供了基础。

细胞的运动迁移过程是细胞与细胞外基质相互作用的结果，迁移过程需要细胞的延伸、粘附、收缩过程在时间上和空间上的协调配合，同时细胞运动迁移过程也是肿瘤细胞形成和转移的基础。Caov-3细胞为人乳头突状卵巢腺癌细胞，不少生物公司提供的细胞迁移实验服务可以研究卵巢癌的形成与Caov-3细胞迁移的关系。

通过细胞迁移实验服务研究癌症的形成与肿瘤细胞的迁移能力，也备受医药研发人员的关注。美迪西是一家医药研发外包服务公司，其生物部在分子生物学、细胞生物学、体外生物学和结构生物学领域有丰富广泛的经验。从最初的cDNA文库构建到药物设计，通过蛋白质纯化，结构测定和分析测定，提供一套完整的生物学服务。

研究表明多种药物对卵巢癌Caov-3细胞的迁移和侵袭能力具有一定的影响作用。消癌平注射液是临床上常见的抗癌药物，其外观为棕黄色的澄明液体，它是一种中药提取剂，具有清热解毒，化痰软坚的功效，它也是一种广谱抗癌药。坎地沙坦为一种医药中间体，通过多步合成可以生成抗高血压类沙坦类原料药坎地沙坦酯，有研究表明坎地沙坦具有抑制卵巢癌Caov-3细胞增殖的作用。Rho相关激酶ROCK1和ROCK2肿瘤细胞迁移和侵袭的关键，这表明它们可能是有用的治疗靶点，有研究者发现了一个强有力的ROCK1和ROCK2的小分子抑制剂RKI-1447对卵巢癌CAOV-3细胞的增殖、迁移及侵袭能力具有抑制作用。分别有研究者针对消癌平注射液、坎地沙坦和小分子抑制剂RKI-1447的对卵巢癌Caov-3细胞的迁移和侵袭能力进行了研究，以探究这三种药物对卵巢癌的作用机制。

1、中药消癌平注射液可抑制卵巢癌Caov-3细胞迁移

为研究中药消癌平注射液抑制卵巢癌细胞Caov-3迁移的机制，利用消癌平注射液干预体外培养的卵巢癌Caov-3细胞，分别应用:细胞划痕实验观察细胞的迁移水平；肿瘤细胞侵袭实验(Transwell小室法)观察细胞侵袭能力；RT-PCR实验检测卵巢癌细胞中金属蛋白酶MMP-9基因表达水平。以金属蛋白酶MMPs特异性抑制剂-Doxycyclin作为阳性对照，同时应用PBS作空白对照。

结果发现消癌平可有效抑制Caov-3细胞迁移，与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，但与Doxycyclin组差异无统计学意义(P>0.05)；消癌平还可部分抑制血清诱导的Caov-3细胞穿过Transwell小室，其抑制效果与Doxycyclin相似；此外消癌平还能够下调MMP-9基因表达水平。因此消癌平下调MMP-9基因表达，抑制卵巢癌Caov-3细胞迁移。

2、坎地沙坦可抑制Caov-3细胞增殖作用，不具有凋亡作用

通过体外培养人卵巢癌Caov-3细胞，并观察血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂坎地沙坦(candesartan)对卵巢癌Caov-3细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，及其与Ras同源基因(Ras homolog gene,Rho)/Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(Rho-associatedcoiled-coil forming protein kinase,ROCK)通路相关蛋白表达的关系。

采用不同浓度(0.1、1、10和100μmol/L)的坎地沙坦处理Caov-3细胞，CCK-8法检测Caov-3细胞的存活率，FCM法检测Caov-3细胞的凋亡率。坎地沙坦(100μmol/L)处理Caov-3细胞24h后，采用划痕愈合实验和Transwell小室侵袭实验分别检测Caov-3细胞的迁移及侵袭能力。蛋白质印迹法检测坎地沙坦(0.1、1、10和100μmol/L)处理24h后，Caov-3细胞内RhoA、RhoC及ROCK1蛋白表达水平的改变，以及ROCK1蛋白下游底物肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chainphosphatase,MLCP)的功能亚基MYPT1(myosine phosphataetargeting subunit 1)磷酸化水平的改变。

结果发现坎地沙坦具有抑制Caov-3细胞增殖的作用(P <0.05)，但对Caov-3细胞的凋亡无明显影响(P> 0.05)。坎地沙坦(100μmol/L)处理细胞24 h后能明显抑制细胞的迁移及侵袭能力(P值均<0.05)；可显著下调Caov-3细胞中RhoA、RhoC及ROCK1蛋白的表达水平(P值均<0.05)，以及MYPT1蛋白的磷酸化水平(P <0.01)。

因此坎地沙坦对人卵巢癌Caov-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力具有抑制作用，这种抑制作用可能与其下调Rho/ROCK通路中RhoA、RhoC及ROCK1蛋白的表达及其下游MYPT1蛋白的磷酸化水平相关。

3、RKI-1447对卵巢癌CAOV-3细胞的增殖、迁移及侵袭能力具有抑制作用

RKI-1447是一种强效ROCK 1和ROCK 2(Rho相关蛋白激酶1和2)抑制剂，它能抑制乳腺癌细胞的迁移\侵袭和锚定非依赖性肿瘤生长。为研究RKI-1447对卵巢癌CAOV-3细胞迁移及侵袭能力的影响，并探讨其可能的作用机制，通过体外培养CAOV-3细胞，以不同浓度的RKI-1447(1、10、20、30、40和50μmol/L)处理CAOV-3细胞12 h后，采用CCK-8法检测RKI-1447对CAOV-3细胞增殖抑制率的影响，同时设未用任何药物处理的CAOV-3细胞为空白对照组。

划痕实验以及Transwell小室侵袭实验检测RKI-1447(1和10μmol/L)对CAOV-3细胞迁移和侵袭能力的影响；分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测RKI-1447对CAOV-3细胞中RhoC m RNA及其蛋白表达的影响；同时采用蛋白质印迹法检测对RKI-1447肌球蛋白轻链2(myosin light chain 2,MLC-2)蛋白及其磷酸化蛋白表达的影响。

结果发现采用不同浓度的RKI-1447作用于CAOV-3细胞12 h后，细胞的增殖被明显抑制，抑制率呈剂量依赖性，半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)约为20μmol/L。RKI-1447浓度为1和10μmol/L处理细胞12 h后，CAOV-3细胞的迁移及侵袭能力被显著抑制(P值均0.05)；Rho C m RNA及蛋白的表达被明显下调(P值均0.05)，磷酸化MLC-2蛋白的表达水平也被明显下调(P0.05)。

因此RKI-1447对卵巢癌CAOV-3细胞的增殖、迁移及侵袭能力具有抑制作用，这可能与其调控Rho-ROCK信号通路中Rho C的表达以及MLC-2蛋白的磷酸化水平相关。

以上的研究表明：中药消癌平注射液可以下调MMP-9基因表达，抑制卵巢癌Caov-3细胞迁移；坎地沙坦对人卵巢癌Caov-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力具有抑制作用，但是对Caov-3细胞的凋亡无明显影响。RKI-1447可以调控Rho-ROCK信号通路中Rho C的表达以及MLC-2蛋白的磷酸化水平，对卵巢癌CAOV-3细胞的增殖、迁移及侵袭能力具有抑制作用。