细胞因子免疫学检验法之ELISA法

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细胞因子多为多肽、蛋白或者糖蛋白，具备良好的抗原性，利用免疫学技术可以方便获得不同细胞因子的抗血清、多克隆抗体或者单克隆抗体。细胞因子检测无论是对免疫学、分子生物学的基础研究，还是对阐明某些疾病的发病机理，指导临床治疗均具有重要的意义。免疫学检测法是细胞因子检测常用的方法之一。

资料表明细胞因子与疾病的病理过程密切相关，细胞因子检测及其基因表达状况的测定正呈上升之势。美迪西不仅可以为客户提供基于Bio-Plex 200、流式CBA、MSD、Luminex系统等全面进行各种single plex或multiplex的细胞因子检测，还建立了一系列相关的免疫学检测平台，用于细胞因子的检测。

1、细胞因子酶联免疫吸附法ELISA检测法

酶联免疫吸附法ELISA是一种特殊的试剂分析方法，它是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，其试剂易于保存、结果判断较为客观，是目前实验室检测抗原抗体最经济、最普遍的试验诊断方法。ELISA法适用于测定细胞培养上清、血清、血浆及组织液中的样本，干扰小可以测到每毫升纳克水平的细胞因子的水平。

ELISA基本原理是：

1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。由于酶的催化频率很高，故可放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

3）在测定时，将待测抗体（抗原）、酶标抗原（抗体）与固相抗原（抗体）结合形成免疫复合物，经洗涤使免疫复合物与待测抗体（抗原）呈比例，加入酶反应物使其与固相上的酶反应比那的，根据颜色做定性或定量分析，得出检测结果。

2、细胞因子酶联免疫斑点（ELISPOT）检测法

酶联免疫斑点（ELISPOT）检测法是基于定量夹心ELISA法原理，将刺激后的细胞滴加到包被在贴PVDF微孔中，放置于37℃孵育。在孵育的过程中，细胞分泌的细胞因子即会被包被的抗体所捕获，最后用不溶性的酶联底物进行显色，每一个显色点（斑点）代表一个分泌细胞因子的细胞。通过专用的ELISPOT分析仪或在显微镜下进行计数，就可以进行分析。   

ELISPOT法可以在单细胞水平对细胞因子（CK）分泌细胞进行检测。由于是单细胞检测，ELISPOT比ELISA具有更高的灵敏性，能从20万—30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。并且该方法综合了普通ELISA方法的高特异性和准确定量的优点，而且具有生物活性分析得出与功能相关的结果的优点。

3、细胞因子双抗夹心ELISA检测法

双抗体夹心法需制备针对细胞因子不同位点的两个单克隆抗体，先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，再用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出捕获的抗原量。

该方法可用于抗原检测，例如细胞因子、激素、蛋白质、细菌和病毒等，是目前检测抗原最常用的ELISA方法。

4、细胞因子免疫印迹法Western Blot检测法

Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞或者组织样本中的蛋白，经转膜、封闭后目标蛋白与特有性一抗结合，再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的第二抗体起反应，经过底物显色，分析曝光条带的位置和灰度分析获知目标蛋白在样本中的表达情况。

Western Blot法结合了凝胶电泳和固相免疫测定两种技术的高特异性和高敏感性，可以对目标蛋白进行定型和半定量的分析。通过抗原抗体反应对目标蛋白的表达进行半定量检测，还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析。WB作为一种方便可靠的研究工具，将与谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用。由于细胞因子分子量比较小，有些用Western Blot进行检测不合适。

免疫学检测法的主要特点是基于抗原抗体反应，反应简单、快速，实验重复性好，大量商业化试剂盒也都是基于这种检测方法。但是，由于仅仅基于分子间免疫学反应，所测得细胞因子含量，并非等同于具备生物学活性的折叠正确的细胞因子，所以，在很多情况下需要借助于生物学检测法最终确定细胞因子生物学活性。

细胞因子作为临床和基础研究的重要生物学分子和检测指标，其生物活性测定方法选择的核心依据是该细胞因子与特定靶细胞在特定培养条件下的反应性。结合免疫学方法对细胞因子含量的初步分析，并通过选取适当的体外细胞培养模型，我们才能获得相对准确的细胞因子的生物学活性指标。

5、细胞因子免疫学检验法常见问题总结：

（1）ELISA 试 剂 盒 主 要 有 哪 些 试 剂 ？

ELISA 试剂盒中主要有

1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；

2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；

3）酶的底物；

4）标准品；

5）结合物及标本的稀释液；

6）洗涤液；

7）酶反应终止液。

（2）造成ELISA测定结果不正常的因素主要有：

1）标本因素：样本需新鲜采集，防止污染，且准确稀释至适当的倍数。

2）试剂因素：ELISA试剂盒在保质期内，其他试剂如蒸馏水的水质等。

3）操作因素：注意操作细节，如加样不可太快，避免加在孔壁上；洗板过程中注意洗液不能溢出孔外；显色要注意控制时间等。

（3）ELISA 试剂盒（96 孔规格）一般可以进行多少个样本的检测？

标准品孔和待测样本孔需进行复孔操作以保证数据的可信度。每次需将标准品按照7-8个梯度稀释以制备准确的标准曲线。一次96孔板实验可以进行20-25个样本的检测工作。

（4）抗体使用有哪些注意事项？

使用抗体前需仔细阅读说明书，了解抗体的保存条件以及不同用途下的推荐稀释比例。较高浓度的抗体（>0.5mg/mL）通常性质更稳定，受生产工艺和成本控制等因素影响，不同品牌的抗体的浓度也不相同，所以购买时应注意比较，经验不足的实验者往往被抗体的体积迷惑，要注意相同质量下低浓度的抗体体积反而更大。

（5）什么是WB的灰度半定量分析？

通常用Image J 或photoshop软件对各个样本的目的蛋白及其内参蛋白曝光后胶片的灰度值进行计算，按照灰度值的高低来半定量分析各个样品中蛋白的表达差异。