通用PCR的综合讲解（原理、材料、实验方法、注意事项）

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一、引言
Mullis等在1983年建立的PCR技术已成为分子生物学、遗传学等学科研究领域的经典实验方法。近年来,该技术本身获得了长足发展,可靠性不断提高,在PCR基本原理的基础上,发展了一系列新的概念和实验方法,在生命科学研究中具有重要价值。随着该技术应用的普及和
入,某些问题也越来越突出。其中问题之一是引物,引物设计的合理与否,合成和纯化质量的好坏,直接关系到PCR反应的成败。不少实验室已花费大量时间和昂贵资金用于各种特异引物的设计与合成。生物种类繁多,核酸序列千差万别,以致有大量核酸片段无精力按已知序列设计成引物后扩增。于是,探索通用引物部分代替特异引物,建立通用PCR( universal PCR)是十分实用的
二、原理
常规PCR技术的基本原理是以扩增的目的基因DNA分子为模板,必须采用针对特定目的基因的特异性引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸至完成新的DNA的合成。通用PCR作为一种PCR相关的技术,通过针对不同种类病原体保守区基因的通用引物,能一次性扩增该组病原体的所有靶基因片段。与常规PCR一样,通用PR主要过程包括样品总DNA的提取、引物设计、PCR扩增及扩增产物的分析,它的特点是采用了通用引物通用引物是一段人工合成的寡核苷酸序列,能互补于不同生物体类群DNA序列共有的保守区用于作为PCR的引物扩增一类生物体中几乎全部成员的核内或细胞器内某个特定基因片段通用PCR技术根据Ta酶的作用原理,结合PCR反应液中各个反应因素和PCR扩增时的温度和时间变动参数的紧密联系,巧妙地创建了一个新的PCR工作平台和扩增环境,使Taq酶能在同一条件下扩增各种不同类型样品的某个特定基因片段。因此,通用PR技术的应用,不但最大限度地减轻了使用者不必要的工作量,也减少了出现操作误差和交叉污染的机会,而且加快了检验速度。与此同时,也使检测成本大幅度降低
三、材料
①基因组DNA.
②透用引物。
③TE缓冲液
④其余同常规PCR
四、方法
L,引物的设计
引物设计是通用PCR中的一个重要环节,这类通用引物不是指普遍意义上的“通用”,而是狭义的通用。一般引物为20个碱基左右的脱氧寡核苷酸。通用引物的设计原理是,在不同目标核酸片段两端寻找共同的保守序列。生物种往往存在大量的种、群、型、株。在进化过程中,尽管核酸序列发生了许多变异,但仍有部分短片段序列保持相同或极相近。按照这些保守序列可合成适用范围不同的通用引物,经PCR扩增分离,检出不同目标DNA片段
目前已设计出细菌或真菌的通用引物,但至今尚无用以检验所有病毒的引物,不过仍可设计出与某些病毒家族保守片段互补的通用引物,如疱疹病毒的DNA聚合酶基因、糖蛋白基因4不NA基因是目前常用的用于设计通用引物的靶基因,真核生物的1RNA基因和原核生物的16 SrRNA基因相对分子量适中,又具有保守性和存在的普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高,因此,常用来作为微生物序列分析对象1例如尹秋生等从12种支原体的165与23rRNA核酸序列中选择了两端高度保守的核酸序列,引物序列为:5- TOGTAACAAG2 GTATCCCTAC3和5cCAT( T/C)CAC(C/T)AAAA/T) ACT CT3作为支原体通用引物,一次PCR扩增就能检测出12种支原体,为支原体的检验
罗雯等选取10种具有代表性的病原菌,采用通用引物PCR,5· AAACTCAAAGGAATTGACGG-3和5′ GACGGGOGGTGTGTACAA-3‘对其16 S rRNA基因进行扩增,建立一种快速检测病原菌的方法以利于临床诊断
Wahyuningsih等建立了一种快速简单的检测系统性假单胞菌病患者血清中白假单胞菌DNA的方法。他们在真菌rRNA基因的核糖体非编码转录区(TrS)设计了一对通用引物,血清标本经试剂盒提取DNA,通用PCR进行扩增,扩增产物用生物素标记的白假单胞菌特异性探针杂交后用酶标法测定,提高了白假单胞菌的检出敏感性
2.基因组DNA的提取
(1)细菌中提取DNA用酚氯仿抽提法提纯细菌DNA:取1ml菌液,3500r/min离心收集菌体,加入200lTE缓冲液(pH8.0)制成菌悬液,再加入120410%S8轻轻混匀,置60℃水浴30mn。随后,加入等体积酚氯仿(1:1),轻轻混匀,12000/min离心10min后,取上清,加入0.25体积无水乙醇和0.1体积5mol/L醋酸钾,12000r/mn离心10min,取上清,加人2体积冰冷的无水乙醇,于一20℃静置30min后,12000/min离心1min,去上清,沉淀用70%乙醇洗2次,无水乙醇洗1次,干燥后,加入适量TE(pH8.0)溶解
2)真菌DNA的提取
①取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉
②加入4m提取液,快速振荡混匀
③加入等体积的4ml的氯仿异戊醇(24:1),涡旋3~5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本
④1000r/mn,4℃离心5min
⑤上清用等体积的氯仿异戊醇(24:1)再抽提一次(10000/min,4℃离心5min
⑥取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置
⑦用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500TE中
③加入1 aI RNase A(lomg/ml),37℃处理lh
⑨用酚(pH8.0)-氯仿异戊醇(25:24:1)和氯仿异戊醇(24:1)各抽提1次(1000/min,4℃离心5min
②取上清,加入1/10体积3mol/L.NaAc,2.5倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀3min以上
①沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200TE中,一20℃保存备用
3)组织细胞DNA的提取从消化过的组织中提取DNA,组织在100mmol/ L TrisH8.0)、10mmol/ L EDTA、100mmoM/ L NoCI,0.1%SD、50 mmo/L DTT、0.5g/m蛋自酶K缓冲液中3℃消化几小时。DNA用酚抽提两次,用酚氯仿(1:1)提纯一次,再用氯仿提纯2次,纯化的样品经离心透析或乙醇沉淀进行浓缩
3）PCR反应体系
五、注意事项
①对于许多不同个体或生物中相同基因的扩增及测序研究,必须严格地避免在DNA分离及制备扩增产物时出现交又污染。在配制PCR反应液时,只能使用带活动枪头及活塞的吸量器用于扩增DNA的吸量器绝不能再用于组织DNA的分离或在另一轮扩增前稀释DNA,不含DNA
②通用FCR检测样本时,极易被相关生物污染造成假阳性,所以建议每次PCR扩增时设定阳性和阴性对照
③用通用PCR检测细菌亦可出现假阴性反应,其发生原因有多种,包括标本中含有PCR抑制物质和消化提取DNA过程中细胞裂解不完全等
④由于通用PCR相对于经典PCR特异性较弱,可以通过优化反应条件,或用降落PCR( touchdown PCR)等提高检出率
六、应用
序列的快速扩增使在DNA序列水平上进行大量的种群研究成为可能,单链扩增可对几十或几百个个体进行快速测序而不经过以前所需的繁项的克隆步骤。一旦得到了一组具代表性的序列数据,可用更方便而简单的分析方法,如用等位基因寡聚核苷酸探针来获得等位基因的序列数据。
2.临床检验的应用
(1)临床上对深部致病真菌的检测目前真菌感染的诊断主要依据传统培养法,且对真菌菌种仍主要依据形态学和生理学等表型进行鉴定,往往周期长、效率低。而早期诊断能提高机会性真菌感染患者的生存率, Wahyuningsih等建立了一种快速简单的检测系统性假单胞菌病患者血清中白假单胞菌DNA的方法。他们在真菌rRNA基因的TTs区设计了一对通用引物,血清标本经试剂盒提取DNA,通用PCR进行扩增,扩增产物用生物素标记的白假单胞菌特异性探针杂交后用酶标法测定,结果在16例培养阴性的对照组和11例非系统性假单胞菌感染的标本中,均未检出白假单胞菌DNA;而在所有血培养阳性的标本中PR结果均阳性;在3/9例血培养阴性,但有系统性假单胞菌感染风险的惠者中,检出白假单胞菌DNA。说明通用PCR对血清标本中自假单胞菌的检出敏感性高于培养法。刘军等人通过通用PCR技术对临床标本进行真菌DNA检测,证实通用PCR方法在临床深部真菌感染的检测其有快速准确的诊断价值,具有临床的可行性
(2)快速全面检测感染人体多种常见支原体和衣原体的应用如解联尿原体( Orealla道炎,其感染率分别为40%-50%和10%-20,近年有文献报道,发酵支原体与AS发病有关,是AID的协同因子,除对人体致病外,支原体还常常感染动物和细胞培养物细胞培养物被支原体污染的污染率在20%~50%之间田。通过通用PCR方法检测临床标本的检验方法,使用通用PCR扩增沙眼衣原体相对保守的基因区,扩增产物用限制性内切酶处理作RFLP分析,能够区分不同型别,许多研究都已表明,PCR较培养法和酶联免疫分析法(ElA)都要敏感,而且PCR对于有症状或无症状人群同样敏感
(3)对非典型分枝杆菌基因型别、物种鉴定的应用非典型分枝杆菌生长缓慢或难以培养。随着分子生物学技术应用于临床,人们已经能用快速敏感的通用PCR技术结合生物芯片技术来检测非典型分枝杆菌, Gingeras等在通用PCR的基础上,构建了对非典型分枝杆菌进行基因分型、鉴定的基因芯片。他们首先设计了一对针对非典型分枝杆菌保守基因RNA聚合酶B亚基(rpoB)基因的通用引物, rpoB(5 CCCAGGACGTGGAGGCGATCACACCGCA3)和rpoR(5 GTCGCCGCGTCGATOGCOGCGC3),用这对通用引物扩增了各种非典型分枝杆菌靶基因上705bp的产物,然后在这段扩增产物上,设计了各种非典型分枝杆菌的特异性探针将这些特异性探针构建成一个高点阵的基因芯片。他们对121个临床标本同时进行了基因芯片杂交,165:RNA基因和rpB基因双脱氧核背酸测序,结果显示3种方法鉴定的非典型分枝杆菌种类基本一致,提示结合通用PCR技术的基因芯片在非典型分枝杆菌的基因型别、物种鉴定上大有作为
七、小结
与经典PCR相比,通用PCR的应用把系统发育的序列比较分析范围扩展到了纲或门的分类水平上。而且此法对鉴定标本和划分生物类型在种群中的位置起重要作用,面对生物种类繁多陵酸序列千差万别,通用PCR技术的应用,不但最大限度地减轻了使用者不必要的工作量,也减少了出现操作误差和交叉污染的机会,而且加快了检验速度。与此同时,也使检测成本大幅度降低。
通用PCR作为一种基本的分子生物学技术,通过与其它新兴的基因分析技术结合,在医学微生物的检测,鉴定和分型中有着广的应用前景,为医学病原体的分类与快速鉴定,尤其是对传统培养难以培养的微生物和未知菌的鉴定提供了全新的方法