长片段PCR介绍（非常详细）

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一、引言
常规PCR反应可以扩增到3~4kb的DNA片段,而超过5kb的DNA片段就已经很难扩增出来了。虽然有人可以扩增出5~15kb的DNA片段,但产量很低。造成常规PCR扩增长片段DNA效果不好的原因有以下几点:常规PCR反应中应用的耐热DNA聚合酶(如Taq酶)缺乏3→5核酸外切酶活性,不具备很好的校读功能,因而具有较高频率的错误碱基的掺入,不能有效扩增长片段DNA;较长的模板DNA容易形成高级结构,使DNA聚合酶难以与模板结合,也就实现不了其聚合功能;较长的模板DNA变性存在困难;缓冲液在PCR高温条件下可能会失去缓冲能力,造成模板DNA和产物DNA的损坏;二价阳离子在高温条件下也会促进DNA的降解。要想较好地扩增出长片段DNA,必须解决上述5个问题。其中最为关键的是第一个问题,其它问题可以通过调整反应条件给予解决。第一个问题的解决需要利用一种具有及时切除错配碱基的酶。自然界中存在这样的酶,例如Pfau、Vent、DeepVent等,它们具有3′→5核酸外切酶活性,具有校读功能,但链延伸能力较弱,单独使用此酶也不能完成长片段DNA的扩增,需要和常规PCR中的DNA聚合酶联合使用。1994年,Barnes等首次将两种DNA聚合酶联合起来成功地扩增出35kb的DNA片段。不久,Cheng等2)用相似的方法以ADNA为模板扩增出42kb的片段和以人基因组DNA为模板扩增出22kb的片段。由此也就真正形成了一套长片段PCR(long PCR、 long range PCr或 long and accurate PCR)的技术方法。
二、原理
长片段PCR中用两种DNA聚合酶进行反应,一种是用常规PCR反应中应用的耐热DNA聚合酶(常用Taq酶),它具有很强的延伸能力,依赖此酶进行链的延伸。另一种是具有3′→5核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶(常用Pfu酶),它具有较好的校读功能,可以将错配的碱基切割下来重新利用第一种酶进行链的延伸。两种酶各有优缺点,充分利用第一种酶的延伸能力和第二种酶的校读功能,使两种酶在反应中相辅相成,完成长片段DNA的扩增。
三、材料
模板DNA可以来源于微生物(包括细菌、病毒等),培养的细胞,血液样品,动物组织以及各种质粒DNA(见注意事项)。
10×PCR缓冲液:500mmol/ LTris-Cl(pH9.0),160mmol/L硫酸铵,25mmol/ LMgCl22,1.5mg/ml牛血清白蛋白(见注意事项,,)
dNTPs:20mmol/L,pH8.0。
正向引物:20ymol/L。
反向引物:20ymol/L。
热稳定DNA聚合酶混合液:0.187UPfu(Stratagene)和33.7 U Klentaq1( ABPeptdes)。在长片段PCR反应中使用效果较好的聚合酶组合见表1013。要根据各种聚合酶的特点选择用于长片段PCR的酶(见注意事项)。



TE缓冲液:10mmol/ LTris-HCI(pH8.0),1 mmol/L Na2EDTA。
10×TBE缓冲液:90mmol/ LTris,89mmo/L硼酸(pH8.3),2.5mmol/ L EDTA
琼脂糖凝胶电泳试剂。
0.5ml离心管、PCR仪、移液器和微量加样器的tip(见注意事项、)。
四、方法
1.引物设计
引物设计的原则应遵守常规P(R引物设计原则,即避免形成二级结构及引物二聚体等。另外,在长片段PCR中引物3末端核苷酸的特异性对长片段扩增尤为重要,应与模板严格配对,且要注意两引物的3末端不能互补。引物长度通常比常规PCR的引物稍长些,在30~35个碱基,过长不会增加扩增的效率,过短会减少扩增的特异性。两条引物的解链温度趋向相等是尤其重要的。如果两条引物的解链温度超过1,可能会造成错误引导以及一条链的优势扩增等问题。用于长片段PCR的引物用全自动DNA合成仪合成后,一般不需要进一步纯化。然而,如果寡核苷酸引物经商品化的树脂进行柱层析纯化或者经变性的聚内烯酰胺凝胶电泳纯化,纯化后的引物用于扩增低丰度的mRNA时常常会更有效。
2.模板的制备
长片段PCR对于多种类型的模板都能有效扩增,例如重组BAC、PAC、黏粒、λ噬菌体克隆、高分子量基因组DNA和由RNA反转录得到的cDNA。DNA模板的平均长度至少应该是预期的PCR扩增产物长度的3倍以上。模板DNA应该尽可能有较高的纯度。作为长片段PCR的DNA模板的纯化制备,最好的方法是使用超速离心机进行CsC平衡密度梯度离心,然后用TE(pH8.0)缓冲液进行透析。也可用磁珠吸附长片段的DNA得到较纯的模板。已被轻微损伤的模板,应用大肠杆菌核酸外切酶处理,能够部分消除损伤模板对扩增反应的影响,可大大提高扩增效果(见注意事项)。
3.反应体系
按下列次序将各种试剂加入到0.5ml的离心管中:
510×PCR缓冲液;
520mmol/L4种dNTP混合液;
1l20pmol/L正向引物;
1l20pmol/L反向引物;
0.2l热稳定DNA聚合酶混合液;
100pg~300 ngdna模板。
加H2O补足至50l
如果PCR仪没有配置加热盖,PCR反应混合液的上层加入矿物油或石蜡油约80l,以防止液体挥发。PCR反应结束后,可以用150dl氯仿抽提去除。
4.反应参数
93~942min
92~9715s~1min,60~671min,685~20min,25~30循环687min
般来讲,常规三阶段热循环法可以实现长片段的扩增。但是,如果引物大于30个碱基,退火温度在65~70之间,采用两阶段热循环法扩增效果更好。复性温度的设置依赖于寡核苷酸引物的熔解温度(即解链温度)。因为用于长片段PCR的引物长度一般是27~30bp,因此用于长片段PCR引物的熔解温度比一般PCR引物的熔解温度高。聚合反应的时间应根据靶基因的长度按每分钟聚合1000bp的速率来确定。聚合时间过于延长不能改善扩增产物的特异性或产量。变性的温度和时间是影响长片段扩增非常重要的因素,高温可以损伤模板DNA,使得DNA聚合酶终止合成。减少模板损伤常采用的方法是:采用尽量低的变性温度及尽量短的变性时间。延伸时间根据扩增片断的长度和所选用酶的特点而定,时间不能过长,以免形成非特异扩增。后期反应中每次循环递增延伸时间的办法有利于长片段的扩增。热启动可以减少非特异扩增。对于难于优化的模板来说,用每循环降低退火温度的降落PCR(touch down PCR)方法,以实现对反应条件的自动调试,有时会得到理想的扩增结果
5.扩增产物的检测
目前最常用的检测方法是用琼脂糖凝胶电泳再以适当大小的DNAMarker来分析扩增结果在许多情况下,扩增产物太少以至于用常规的溴化乙锭染色不能检测到目的条带。在这种情况下,用SYR金颗粒对凝胶上的DNA样品进行染色或转移凝胶上的DNA样品到尼龙或硝酸纤维素滤膜上用探针进行Southern杂交予以确证。
五、注意事项
对于不同来源的模板DNA,要进行具有针对性的严格优化。在某些情况下,一些非特异片段会干扰长片段PCR扩增,可以减少酶量和降低盐浓度来增加PCR产物的特异性。对于有些模板,其二级结构过于复杂或不易得到较高的浓度,一次性实现长片段扩增非常困难。采用融合PCR方法就简单多了。先分段扩出、相互部分重叠、然后将覆盖整个长片断基因组的两段或几段PCR产物进行融合反应,以形成全长DNA,再以此为模板进行长片段PCR,可以成功实现长片断的扩增。模板DNA的用量在100pg~2g之间,模板量太少,扩增产物往往检测不到,模板量太多,扩增产物的特异性显著降低。最好是针对模板DNA进行预试验,以确定最佳模板量。某些轻微损伤的模板用核酸外切酶处理的原因是因为核酸外切酶除了具有3′→5′外切酶活性外,还具有对无嘌呤、无嘧啶碱基的DNA部位显示特异性内切酶活性,对3末端无羟基的DNA显示了3磷酸酶活性以及RNaseh活性,降解有缺口的DNA,保证了模板的完整性。
100mmo/LKCl可以替代10×PCR缓冲液中的硫酸铵。小牛血清白蛋白可以被多种其它添加剂所替代。这些添加剂的理论作用模式及作用的最终浓度见表10-2
这些添加剂能够促进长片段的扩增,可能是通过增加聚合酶的稳定性、降低解链温度以及减少模板链损伤而发挥作用。因为在高温情况下长片段DNA模板极易发生脱嘌呤作用和脱氨基作用,甘油和二甲基亚砜等添加剂可以有效地减缓变性的温度和时间,最小程度地减少DNA的损伤。并且在某些情况下,同时添加几种添加剂比只加入一种更有效。添加剂浓度过高时会抑制酶的活性,因此也要对其应用浓度进行优化。



在低pH值的环境下,长片段模板DNA容易发生脱嘌呤作用而受到损伤,因此,缓冲液最好采用比Tris-HCI的缓冲能力更强的三(羟甲基)甘氨酸(tricine),这样pH值才会在高温环境中变化较小,减少对模板DNA的损伤。
Mg2+浓度一般要比常规PCR反应中的浓度高,约在2~6mmol/LMg2是DNA聚合酶活性依赖因子,不仅影响聚合酶的活性和忠实性,也会影响引物的退火、产物的特异性和二聚体的形成等。Mg2浓度过低会影响到酶的活性,过高则会降低酶的忠实性和引起非特异扩增。但是目前在长片段PCR反应中,还没有确定一个最佳的Mg2+浓度。通常解决的方法是,在能够保证扩增产率及特异性的前提下,选用尽可能低的Mg2浓度,以最大限度提高聚合酶的保真性。
在长片段PR反应中,聚合酶的保真性至关重要。要根据各种DNA聚合酶的特性选择用酶。各种DNA聚合酶的特点、要求条件以及特性评价见表10-3




长片段PCR反应用管应该使用薄壁管,反应体积也不宜过大,以免影响热传导效率。不同的PCR仪对反应也有影响,相同的扩增条件在不同的热循环仪上会得到不同的实验结果,可能是由不同PCR仪温度升降的速率不同所致。
PCR仪可以是Perkin-Elmer9600或9700,也可以是 Eppendorf公司的可以是 MJResearch公司的PTC100。
六、应用
长片段PCR技术方法的建立,大大拓宽了PCR技术在分子生物学、基因组学和临床诊断等各个领域的应用。
1.长片段DNA的克隆
由于真核生物的基因存在内含子和外显子,一般基因较长。常规PCR技术很难扩增全长,而长片段PCR为扩增这样的基因提供了技术平台。由于能够扩增大到20~50kb的片段,将使从cDNA中分离完整的基因简便易行,从而不必费时地从基因组文库中筛选目的基因。有人用长片段PCR克隆到了全长的HLAB基因,同时获得了HLAB的新的等位基因。Henkel等人将长片段PCR和反向PCR融合在一起,结合杂交技术,成功地扩增到了包含鸡内生原病毒元件的长片段DNA。另外,用长片段PR可以从未克隆的mRNA延伸产物的混合物中产生大的cDNA分子。大的基因组片段可以从复杂的基因组杂交细胞系和显微解剖或流式细胞仪分离的染色体区段中得到。
通过对感染性克隆的反向遗传学操作,实现了对RNA病毒的基因操作,在深入阐明病毒基因组结构与功能、构建新型病毒载体以及筛选疫苗候选株等方面有很好的应用前景。传统构建克隆的方法涉及许多亚基因组片段的克隆与连接,非常繁琐费时,长片段PCR技术的发展使得次性获得病毒的基因组序列成为可能,因而大大简化了全长cDNA克隆的构建过程。为了了解来源于病人不同组织的HIV-1突变体病毒在定向性运动和增殖动力学方面的差异,Dittmar等用长片段PCR从一个HIV患者外周血单核细胞、淋巴结、脾、脑和肺中扩增出HIV的全长DNA,并在其5′端加了此种病人特异的长末端重复,从而构建成了具有繁殖能力的HIV病毒。通过对这些重组病毒定向性运动(包括定向于外周血单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)和增殖能力的实验,发现这些重组病毒具有相似的定向性运动和增殖活力,淋巴结来源的重组病毒和非淋巴结来源的重组病毒在定向性运动中没有差别。应用此技术已经成功构建了SF(cpz)、TBE、甲型肝炎、柯萨奇病毒B6和JE等RNA病毒的全长cDNA克隆。另外,以PCR为基础的染色体步行技术也因长片段PCR的出现得以更广泛地应用。
2.基因组研究
在基因组多样性研究中,起关键作用的是染色体上多态标记的复合体——单模标本。这种标记对于绘制疾病相关基因以及分析基因敲除小鼠非常有用。有人用等位基因特异的长片段PCR扩增到了CD4的单模标本,发现两个分子标记是分开的:一个是双等位的Alu缺失,另一个是多等位性的重复0。
对扩增片段进行限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP)分析,是常用的基因检测方法,长片段PCR技术的发展增加了RFLP的应用范围及准确度,已应用于检测mRNA分子的突变、基因作图等研究。扩增50kb的靶序列将给分析细菌人工染色体(BAC)克隆和P1来源的人工染色体(PAC)克隆以及小的酵母人工染色体带来很大的方便。Skiadas等人"建立了一种光学PCR技术,此技术是将长片段PCR和光学基因组作图结合起来而建成的。它可以对细菌人工染色体和大的基因组DNA分子进行限制性酶切图谱分析,从而对序列未知的基因组位点进行基因组作图。此技术的优点是快速、不需要克隆载体,会得到高质量的物理图谱。
另外,长片段PCR技术可以用于微生物分型、基因型及准种分析等多个研究领域。炭疽芽胞类杆菌的基因组序列是极其保守的,很难用常规的方法检测到不同菌株之间的DNA差异。近来有人用长片段PCR方法建立了一种可以简单高效地检测不同菌株之间差异的方法。针对炭疽芽胞类杆菌DNA序列中的重复元件设计单一引物,可以扩增到10kb左右的多个DNA片段。通过对多种菌株扩增这样的片段,就可比较出不同菌株中存在的片段多少和片段大小的差异,从而可以区分不同的菌株,并可确定不同的菌株的特征。
随着多种基因组序列的测序完成,长片段PCR将会更加发挥其优势,在功能基因组时代占据一定的位置。例如,长片段PCR分析一个群体中的大分子的限制性片段长度多态性;通过扩增包含不同数目和长度内含子的基因组DNA片段,可以弄清楚内含子/外显子的边界;分离位于已知序列旁边的未知序列,产生一系列大小不同的扩增产物,以方便填补物理图谱中未克隆的DNA间隙,获得紧密相连基因之间的次序和方向;扩增散布重复序列之间(或不同类重复单位之间)的DNA区域,有利于DNA片段的指纹分析以及毗连DNA片段的排序和定向;应用于定向转座子介导的作图和测序,这是一种潜在的快速高效分析100kb甚至更大片段的有力手段等。
3.基因突变和基因表达的检测
长片段PCR技术在检测基因突变和基因缺失方面有十分广泛的应用。TSC2基因的大片段突变是造成常染色体显性遗传病结节性硬化症(TSC)的原因之一。对TSC基因大片段基因突变的常规检测方法是Southern杂交和原位荧光杂交,但这些方法具有需要DNA量大等缺点。用长片段PCR只需要较少量的基因组DNA,并且很容易证实突变位点的序列。Dabora等人用长片段PCR检测到6个TSC病人中存在着不同的DNA缺失,缺失片段大小分别为45kb、39kb34kb、1.4kb、1.3kb和10.1kb。这一方法的应用为TSC的诊断提供了更多的理论依据。在另常染色体遗传病多囊肾中,PKD基因的突变可能是其发病的原因之一。当用长片段PCR扩增24个病人样品的PKD基因时,发现了7种突变,其中有两个缺失(一个缺失3kb,个缺失28bp),一个单碱基插入突变和4个核苷酸替代。因此,长片段PCR技术为探测长序列复杂基因的突变提供了可能,从而为检测致病基因的突变和缺失带来了方便。另外,有人已经用长片段PCR技术将病毒基因组和线粒体基因组扩增出来,以便寻找基因突变和基因缺失。
在检测基因重排和基因融合方面,长片段PCR可扩增含有可扩展的三联体重复序列的基因如亨廷顿(Huntington)病基因,为亨廷顿式病进行症状前诊断成为可能。Friedreich共济失调症病人的FRDA基因内含子的扩增产物显示,GAA三联体扩展很可能与发病相关。并且,用长片段PCR技术研究表明,肌强直性营养不良病与享廷顿病和Friedreich共济失调症有相似的发病模式。长片段PCR用来探测染色体转位位点的基因重排对临床诊断血液性恶性肿瘤非常有帮助。在mRNA水平对这些疾病的诊断通常要依赖于RT-PCR和Northern分析;在DNA水平,由于基因重排造成的基因跨度远远超过了传统PCR的扩增范围,用长片段PCR可以解决这个问题。近来有人用长片段PCR技术建立了一套基于基因组PCR的探测系统,成功证实了5号染色体的NPM基因与2号染色体ALK基因的融合,融合后的基因会产生一种不可思议的转录体(NPM的N端序列与ALKC端序列的融合转录体)。用长片段PR对11个肿瘤样品中两个基因融合位点的DNA扩增发现NPM和ALK基因融合的位点是唯一的,并且在两个染色体上有相同的内含子参与其同源重组过程。也有人在B细胞肿瘤中检测到了在染色体转位处有多种基因融合。
另外,在检测特异表达基因方面,将RT-PCR和长片段PCR结合起来,可以扩大对稀有转录体和组织特异表达基因的检测范围。有人用此技术扩增到了135kb的差异cDNA。在基因打靶研究中,寻找到一种简单高效的筛选阳性克隆的方法是至关重要的。Iay等人(用长片段PCR成功地建立了这样一种方法。首先从基因组文库中用长片段PCR扩增出目标基因及其两侧特异的序列,用此序列设计引物,再次用长片段PCR检测中靶情况。他们对缩胆囊素和胃泌激素基因打靶的胚胎干(ES)细胞的实验表明,此方法对于快速准确地鉴定胚胎干细胞中等位基因位点的同源重组情况是非常有用的。
七、小结
自从1994年建立长片段PCR技术以来,此方法在不断发展完善中日渐成熟,形成了一套完整的技术体系。有很多公司都推出了自己的试剂盒,大大加强了此技术的应用。此方法最大的优点在于可以扩增出大于10kb的DNA片段。与将几个常规PCR产物再进行融合的方法相比,具有操作简单、快速高效等特点。但是,它也具有不可避免的缺点:要求较高质量的模板,反应体系和参数需要多次优化,得到的产物量可能很少以至于检测不到,得到的产物可能特异性不高等。但所有这些问题都不是制约长片段PCR应用的要素,可以通过相应的方法得以解决。需要对长片段PCR进一步改进的地方包括耐热DNA聚合酶的组成、反应缓冲液的成分、热循环的条件和检测长片段PR产物的方法,以使此方法被常规地用于特异地扩增长片段PCR。在功能基因组时代,由于长片段PCR技术在扩增长片段中的优势,此技术将会更加广泛地得以应用,并将对分子生物学的各个方面产生深远的影响。

原文地址：长片段PCR(LongPCR)介绍(超长,超详细)_用户2354056307的博客

ArisXiao

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