《多参数流式细胞术检测急性白血病及浆细胞肿瘤微小残...

惜钥

　　《多参数流式细胞术检测急性白血病及浆细胞肿瘤微小残留病中国专家共识(2017年版)》要点

　　多参数流式细胞术(multiparameter flow cytometry，MP-FcM)是运用不同荧光标记的多种抗 体组合对造血细胞表面或胞内抗原的表达状况进行检测，进而对细胞的系列来源、分化程度、表型异常与否进行分析判断的高通量、高敏感性检测技术，其在恶性血液病的诊断分型、治疗监测、预后评估及治疗靶点筛查中已成为必不可少的实验诊断手段。微小残留病(minimal residual disease，MRD)是指恶性血液病经过治疗达到血液学完全缓解后体内残存的通过形态学等传统方法无法检测到的任何水平的微量肿瘤细胞状态。近年来，也有学者根据现有检测技术的局限性将MRD定义为可检测的残留病。运用FCM检测恶性血液病MRD的研究始于20世纪80年代，利用2～4色FCM对急性白血病的治疗后样本进行检测，并基于在正常细胞分布之外的“空白”区域检测到异常表型的理论对MRD进行分析鉴别。在过去的10年中，随着FCM水平的不断提高，特别是8～10色MP-FCM在MRD检测中体现出敏感性高、特异性好、适用范围广的优势，MRD的FCM检测从小规模样本的临床研究发展到大规模样本的临床验证，目前已成为恶性血液病临床疗效判断和预后分层的重要依据，而基于MRD指导下的个体化治疗可以使不同危险度分层组中的患者避免过度治疗或治疗不足，以提高患者的长期生存率。


　　然而，由于白血病等恶性血液病存在不同程度的克隆异质性、不同治疗方案对免疫表型和克隆筛选的影响、化疗后不同时问点骨髓造血恢复的状况不一、不同基因背景的残留肿瘤细胞在复发时的增殖动力学不同等疾病自身因素的复杂性，以及不同检测中心在抗体组合、荧光搭配、样本处理、圈门策略、分析逻辑、主观经验、质控管理等诸多技术环节中的差异，目前国内外对于MRD的检测和分析还缺乏规范化，导致对MRD检测结果的临床解读和预后评估标准存在不一致性。


　　一、MRD检测原理及方法


　　(一)MRD检测原理


　　FCM检测MRD的原理是通过分析细胞表面或胞内一系列抗原的表达模式来识别只在白血病细胞中出现而正常骨髓中不存在或存在比例极低的免疫表型，即“白血病相关免疫表型”(LAIP)。根据抗原表达特点将LAIP分为以下几种表现形式： 跨系抗原表达、非同步抗原表达、抗原表达量异常、散射光信号异常以及表达少数白血病特异性抗原(如NG2)。


　　检测MRD选用的抗原主要包括三部分： ①设门所用的抗原，为系列敏感性高的抗原，能初步圈定某一系列所有细胞，如T系的胞质CD3(cyCD3)或CD7、B系的CDl9、髓系的CDll7，以及浆细胞的CD38和CDl38。②确定相应系列早期分化的抗原，可识别该系列原始、幼稚细胞群体及亚型，如B系的CD45、CDl0、CD34和核TdT(nTdT)，T系的膜CD3(mCD3)、CD34、nTdT和CD99，髓系的CD34、CDll7、HLA.DR和CD38。③白血病相关的异常抗原，能区分白血病细胞和对应系列的正常幼稚细胞，主要指LAIP涉及的抗原。


　　(二)MRD检测方法


　　在MRD数据分析的实际应用中，主要存在2种方法： 第一种，根据患者发病时的LAIP设计特异性的抗体组合，选择固定的门(gate)对特定的细胞群进行设门分析，例如对发病时具有CDl0+CD38-LAIP特征的B-ALL患者，通常以CDl9+细胞设门，重点分析是否存在CDl0+CD38-细胞;第二种，始终以同系列相同分化阶段的正常细胞作为对照，在每次检测时观察是否存在与正常细胞表型不同的细胞群体，即“不同于正常细胞表型”(DFN)的方法。


　　二、MRD检测抗体选择及常用抗体组合推荐


　　基于MRD检测的方法不同，MRD检测时抗体组合的选择主要参照以下原则： ①有初发LAIP可供参考时，尽可能多地将LAIP涉及的抗原包括在 MRD检测的组合中。②对于没有初发时免疫表型的患者，治疗后如果需要检测MRD，只能参考同类型的白血病出现LAIP的频率，选择出现频率高的抗原及选取较多的抗体进行检测，以免漏检。


　　为了简化MRD抗体组合的复杂性，本学组专家以两种方法中的相关抗原以及高频出现异常表 达抗原的抗体作为骨架抗体，提出了不同类型白血病进行MRD检测较通用的基本抗体组合，在此基 础上，再根据不同患者的免疫表型个体化地补充第三类抗体(备选抗体)，成为较完整的MRD抗体组 合，进行临床检测。


　　(一)MRD检测的抗体选择


　　1.B-ALL：


　　2.T-ALL：


　　3.AML：


　　4.PCN：


　　(二)MRD检测的抗体组合推荐


　　基于目前国内外的报道以及国内各大实验室的经验，本共识对急性白血病以及浆细胞肿瘤的MRD检测抗体组合给出了骨架抗体组合及备选抗体的推荐表(表1、2)。


　　三、MRD检测的相关临床问题


　　有多种因素影响患者的预后分层，如患者的年龄、发病时白细胞计数、白血病亚型、肿瘤细胞的遗传学背景等，这些主要是治疗前相关预后因素。


　　(一)检测样本的选择(骨髓、外周血)


　　(二)检测时间点与频率


　　1.检测时问点与预后判断的相关性：


　　2.检测时间点与骨髓造血恢复的相关性：


　　3.检测频率：


　　(三)检测阈值


　　1.MRD阈值与预后的相关性：


　　2.检测阈值的界定：


　　四、MRD检测的质量控制与标准化


　　除去前面提到的多种因素外，FCM的质控也至关重要。


　　(一)检测体系的标准化


　　1.仪器的标准化及调整频率：


　　(1)光路校准：


　　(2)荧光补偿校准：


　　(3)预防交叉污染：


　　2.方法学准确性：


　　(1)精确度/重复性：


　　(2)特异性和敏感性：


　　(3)稳定性：


　　(4)数据收集：


　　(二)检测流程的标准化


　　1.在开展MRD检测项目前，必须利用相同的抗体组合至少分析20份正常对照标本的抗原表达模式，建立正常骨髓发育模板。


　　2.对于有初发免疫分型结果的患者，首选初发时筛选出的异常抗原(尽可能同时监测多种LAIP)，对治疗后的骨髓标本进行分析。


　　3.如果发病时没有进行免疫分型检测，治疗后每次进行MRD检测时，都需要遵循“DFN”方法，选择较多的抗体，针对同类型白血病出现异常表达频率较高的标志进行检测。


　　(三)数据分析与报告模式的标准化


　　1.数据分析：


　　(1)初步设门：


　　(2)MRD表型的鉴别：


　　(3)MRD水平的计算：


　　2.报告内容及报告形式：


　　(1)报告内容：


　　(2)报告形式示例：


　　〔本资料由朱明恕主任医师根据《多参数流式细胞术检测急性白血病及浆细胞肿瘤微小残留病中国专家共识(2017年版)》编写〕


　　(本共识刊登于《中华血液学杂志》2017年第12期。如欲全面详尽了解，请看全文)


　　2018.3.8