利用昆虫细胞表达系统可表达肠道病毒

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肠道病毒71型为手口足病主要病原体，VP1是EV71的结构蛋白，且EV71主要的中和抗原决定簇集中于VP1上，因此研究EV71 VP1蛋白具有重要意义。有研究者利用昆虫细胞表达系统表达肠道病毒71型VP1蛋白并对其进行纯化，研究结果指出，利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达EV71 VP1蛋白。

在EV71感染过程中，VP1蛋白承担者重要的角色，参与吸附、穿入、脱壳等过程，研究表明针对VP1设计的疫苗能保护实验动物，能抑制EV71感染或减轻感染后症状，这为EV71疫苗开发提供了实验和理论依据。

    昆虫细胞-杆状病毒表达系统是目前病毒样颗粒VLPs制备中最常用的表达系统，其代表产品是葛兰素史克公司的二价宫颈癌疫苗。昆虫细胞-杆状病毒表达系统主要是利用bac-to-bac技术将外源蛋白转座进入杆状病毒 bacmid 中，再将该重组病毒转入昆虫细胞中大量表达，最后外源蛋白自发在细胞中装配成VLPs。美迪西建立了杆状病毒-昆虫细胞表达服务平台，提供包括重组杆状病毒制备、重组蛋白及其复合物的表达与纯化服务。

利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达EV71 VP1蛋白，首先要通过化学合成法合成EV71 VP1基因，然后将EV71 VP1基因插入到供体质粒pFast Bac1中，构成重组质粒pFast  Bac1-VP1，再转入JM190感受态细菌扩增，然后提取重组质粒pFast Bac1-VP1转入DH10BacTM感受态细胞，通过转座从而获得重组质粒bacmid-VP1，采用脂质体Cellfectin Reagent将重组质粒bacmid-VP1转染Sf9细胞。通过SDS-PAGE、Western blot法检测目的蛋白的水平，经镍离子亲和层析，纯化VP1蛋白。

　　结果显示， SDS-PAGE及Western blot法检测获得蛋白的相对分子质量与预期结果一致，Bradford分析纯化后蛋白的浓度为70μg/ml，纯化度达90%。

昆虫细胞表达系统可以行使蛋白的翻译后修饰功能，对目的蛋白进行糖基化，并且可以使得外源蛋白大量积累，同时不含动物病原体。除此以外，由于杆状病毒基因组巨大，可允许多个外源基因同时插入病毒基因组中进行表达，但是这个表达系统并非完美。首先，昆虫细胞糖基化修饰与哺乳动物细胞不同，后者合成的糖蛋白含有唾液酸末端的杂合型N－糖链；而昆虫细胞表达的蛋白糖链仅包含数个甘露糖或海藻糖等的寡糖类。另外，由于目的蛋白与杆状病毒颗粒共表达，容易产生污染，因此，病毒样颗粒的纯化是使用昆虫-杆状病毒表达系统时尤为值得注意的问题。