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电荷异构体的分离分析方法

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发表于 2017-12-15 17:02:00 | 显示全部楼层 |阅读模式 来自 上海
抗体分子的异质性与电荷变异
抗体分子作为复杂的四聚体蛋白,具有质量不均一的特点,即“异质性”。异质性可能来自于抗体分子复杂的生物合成途径,如细胞系及培养工艺影响糖基化,也可能来源于纯化、制剂工艺中产生降解或聚体。
这种异质性也可以宏观表现为:在等电聚焦电泳图上出现弥散或多个条带;离子交换色谱图主峰前后出现小峰。这是由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性,所以,这种现象也被称为抗体的电荷变异。
CIEF图.gif
抗体电荷变异对其药效学的影响
目前普遍认为,抗体的电荷变异可能影响药物代谢。基因泰克公司曾经对上市抗体及临床前抗体药物做过一个总结。得出的结论是:1)电荷变异会影响药物的组织分布及药代动力学。2)增加正电荷,会提高药物的组织停滞,降低血清清除。3)降低正电荷会减少药物的组织停滞,提高药物的全身清除。

电荷异构体的常用分析方法
离子交换色谱(IEC)和等电聚焦毛细管电泳(cIEF)是两种最常用的电荷异构体分析方法。
IEC法非常受欢迎,因为方法耐用且不需要特殊专用仪器,使用液相色谱即可进行分析。IEC的另一个优点是,可以放大到制备级用于分离制备电荷异构体,以便进行更深入的研究。
cIEF法是区别于IEC的另一种常用的方法。在某些案例中,由于IEC分辨率的问题,cIEF可能是唯一的选项。cIEF可以在传统的毛细管电泳(CE)上运行,也可以在全柱成像等电聚焦毛细管电泳(iCIEF)上运行。但是由于过低的样品用量(纳升级),不可用于制备,导致了cIEF和icIEF的局限性。



一种新型高分辨率电荷异构体制备工具
自由流电泳(FFE)是一种高分辨率的电荷异构体分离制备工具,在达到cIEF的分辨率的同时,单次实验分离量可以达到100mg蛋白。整个分离过程在液体中进行以便进行下一步的溶剂交换,且保留蛋白的天然构象。分离的异构体可以进行进一步的结构或生物学活性研究。
FFE 机器.png
FFE分离电荷异构体的原理
FFE分离原理.png
FFE实验数据
1,分离效果

2,使用高分辨质谱进一步结构鉴定


随着对蛋白药物的研究的深入,电荷异构体的结构鉴定与活性研究越来越受到重视。FFE可以作为一种高效率的制备工具,对电荷异构体进行高分辨率大规模制备.
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