探秘CRISPR技术：OneShine CRISPR/Cas9基因敲除细胞文库

wangsheng0726

在张峰向国人展示CRISPR技术的神奇之处后，行业内可谓是炸开了锅，众多企业纷纷将目光投到这个领域之中，希望自己能成为生物行业内的那只“风口上的猪”，“出任CEO，迎娶白富美，走向人生巅峰”，这一切都看似触手可及！

进而，众多生物公司纷纷推出自己独特的CRISPR产品，然而众多的只是冠以“CRISPR”，改头换面，其本质还是一成不变！但在“量变引起质变”的定律下，像往圣生物公司等类型的公司在CRISPR技术上取得了令人可喜的成绩：OneShine CRISPR/Cas9基因敲除细胞文库。

什么是OneShine CRISPR/Cas9基因敲除细胞文库？

以Lenti-CRISPR V2质粒为示例：

gRNA与Cas9蛋白结合于同一个载体上。我们设计合成了12万个gRNA（靶向约2万个基因），分别连接到Lenti-CRISPR V2载体上，然后把12万个质粒混合起来，形成CRISPR/Cas9 基因敲除质粒文库。并且我们将此文库整合到了细胞中，一个125cm2细胞培养瓶中含有约108个细胞，每个细胞被敲除了一个基因，共约2万个基因被敲除，所以含有每个特定基因缺陷的细胞约有5000个（108/2万）。客户拿到细胞后，可进行传代。

相关参数

靶基因物种：人

靶基因数目：19,050

gRNA数目： 123,411

细胞类型：胃癌、乳腺癌、结肠癌等癌细胞系和永生化的细胞系。

怎么应用OneShine CRISPR/Cas9基因敲除细胞文库？

【应用举例：细胞凋亡相关基因筛选】

取细胞文库进行扩增，然后平均分成两份，每一份包含108个细胞，每个细胞被敲除了一个基因，共约2万个基因被敲除，所以含有每个特定基因缺陷的细胞约有5000个（108/2万）。向其中一份细胞中加入放线菌素D、诱导细胞凋亡（A组），在另一份细胞中加入溶剂、作为对照（B组）。A组用流式细胞仪筛选出凋亡细胞A1、未凋亡细胞A2，B组用流式细胞仪筛选出凋亡细胞B1、未凋亡细胞B2。分别对A1、A2、B1、B2进行短测序，检测哪些基因被敲除了。A2中被敲除的基因具有抗凋亡作用，B1中被敲除的基因具有促进凋亡的作用。其它应用：

（1）新药靶点确定与验证

（2）环状RNA上游调控机制分析

（3）Long noncoding RNA作用机制验证

（4）脂肪代谢机制研究

（5）干细胞自我更新、不对称性分裂机制等。

像往圣生物公司这种类型生物公司，并不少见，难得的是在踏踏实实的做事！

     众观全局，CRISPR技术虽异军突起，让人措手不及，但在众多生物公司看来，这也可以说是“天上掉下来的馅饼”，大家的目的也都是一样：如何接到这块“馅饼”！但仅靠“擦边球”，没有核心技术，在这个年代是不靠谱的！ 想靠CRISPR技术实现商业目的，还是要多走走心！