内参抗体选择原则

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内参抗体选择原则

内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

作用：

1. 校正蛋白质定量、上样过程中存在的误差，从而保证实验结果的准确性。

2. 内参亦可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个蛋白免疫印迹显色发光体系是否正常。

内参抗体种类很多，比如β-actin、β-tubunlin、GAPDH、Lamin B等，那么针对自己的实验，我们该如何选择呢?下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则。

一样本种属来源

首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。

1. 哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na+ /K+-ATPase等。

2. 植物来源实验样本，则可以选择plant actin、Rubisco等。

3. 其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参。

二目的蛋白分子量

选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5kDa以上。比如目的蛋白分子量为45kDa，此时不适宜选择β-actin作为内参，可以考虑选择GAPDH或者β-tubulin作为内参。

三目的蛋白表达部位

全细胞蛋白检测一般用GAPDH、β-actin、β-Tubulin抗体等抗体作为内参，而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等，在一些文献报道中，ERK2、TATA binding protein (TBP) 以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为Na+ /K+-ATPase。对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。

知识tips:

PCNA：增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen简称PCNA）由Miyachi等于1978年在SLE（系统性红斑狼疮）患者的血清中首次发现并命名，因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名，以后的研究发现PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标，因此近年来掀起了对PCNA研究的热潮，尤其在肿瘤方面。

ERK2：细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）包括ERK1和ERK2，是将信号从表面受体传导至细胞核的关键，其中ERK1和ERK2的分子量分别为44kDa和 42kDa。磷酸化激活的ERK1/2由胞质转位到核内，进而介导Elk-1，ATF，NF-κB，Ap-1，c-fos和c-Jun的转录活化，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的癌变等多种生物学反应。

四实际的实验环境

以上几条原则只是针对通常情况，但是需要注意的问题是——内参的选择需要考虑实际的实验环境，比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，应考虑这方面因素。

五抗体的选择

对于以上提出的一些内参指标，ABclonal通过大量的客户验证，可为各位实验汪提供以下产品：

二抗选择原则

二抗是相对于一抗的概念，二抗也叫抗抗体。二抗的主要作用是跟一抗结合，起到放大一抗信号，达到检测目的。二抗相对于一抗具有“通用性”，一抗是一对一（Fab区域结合抗原表位），二抗是一对多（Fab区域结合一抗的Fc区域）。只要是同一物种来源的一抗，都可以用针对此物种的二抗进行检测。

一二抗的生产

将一抗来源物种的免疫球蛋白（Ig）的Fc区域去免疫动物。获得针对此物种的二抗。

Q: 二抗来源为什么一般是山羊，绵羊，驴？

首先，二抗的宿主来源跟一抗的宿主来源不是同一物种。

其次，二抗使用量大，所需血清量也较大，选取免疫动物时，对应选择个体大且血量多的宿主动物。如：马、牛、羊、猪等。

二二抗的标记

常见的标记物有：

1. 酶类：辣根过氧化物酶（HRP） 和 碱性磷酸酶（AP或其衍生物APAAP，PAP）

2. 荧光素：Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 488、Alexa 546、FITC、TRITC、RB200、Texas red、Cy3等

3. 胶体金：免疫电镜

4. 放射性同位素：32P、131I

5. 化合物：生物素、地高辛

根据标记物的不同，有对应不同的检测方式和仪器设备。

三如何选择二抗？

如何选择二抗？

1. 首先确认一抗的宿主物种。例如：兔来源的一抗。

2. 选择对应一抗的二抗宿主物种。例如：山羊抗兔的二抗。

3. 根据实验方式和实验目的选择正确的标记物。例如：需要做免疫荧光，就选择荧光素标记的二抗FITC-山羊抗兔。

如何选择荧光二抗？

荧光素：能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光素。

Alexa系列染料后面附带的数字，则大致表示该染料对应激发光的最大波长（nm）。

可用于免疫荧光标记的荧光素  

一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。其中荧光素是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多，目前常用于荧光标记二抗有 以下几种：

【异硫氰酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)荧光标记二抗】
   FITC 纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为 520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。由于FITC是小分子化合物，每一个抗体可标记 几个FITC分子，IgM通常用小分子的荧光素标记，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。然而FITC的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。

【四甲基异硫氰酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC)，Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)荧光标记二抗】
   这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长 (550, 570, 596nm)和最大发射波长（570, 590, 620nm）。尽管TRITC经常和FITC一起在双标记实验中使用，使用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜 作三标记的实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，而且和这两者覆盖都很 少。氪氩灯激发光为488nm，598nm和647nm，分别是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激发波长。因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发, 在流式细胞仪中用FITC作双标，另一种用藻红蛋白（PE）耦联基团要比罗丹明好。TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独 标记染色。

【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)】
   Cy2 耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含 有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景 更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。
  Cy3在氩光灯（514nm或528nm）下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯（543nm）或者汞灯（546nm）下则约75％。 Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大 670nm。在氪氩灯（647nm）下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下（633nm）为63％。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的 实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共 聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。

【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】
   存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋 白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长范围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。

【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】
   耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。

注意：

由于观察荧光需要一 定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。另外，多标记中对探针色彩区分程度的要求。例如，若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的区别明显。如果对灵敏度有更高的要求，则Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。

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