抗原提纯与动物免疫 对抗原的要求是纯度越高越好,尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原,可取1×107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化,如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原,可将抗原所在的电泳条带切下,研磨后直接用以动物免疫。 选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠,鼠龄在8~12周,雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡,可同时免疫3~4只小鼠。 免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同,因动物、抗原形式、免疫途径不同而异,以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2~3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高,融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大,而且单克隆抗体的质量(如抗体的浓度和亲和力)也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3~4天,分离脾细胞融合。
骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞,各种骨髓瘤细胞株均可应用,但应用最多的是Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳,此外,该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×105/ml,倍增时间通常为10~15h。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性应大于95%)。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养,在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml,次日一般即为对数生长期细胞。 在体外培养条件下,细胞的生长依赖适当的细胞密度,因而,在培养融合细胞或细胞克隆化培养时,还需加入其他饲养细胞(feedercell)。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞,制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔,轻揉腹部数次,吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞,其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。 在制备饲养细胞时,切忌针头刺破动物的消化器官,否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至1×105/ml,提前一天或当天置板孔中培养。
细胞融合 细胞融合是杂交瘤技术的中心环节,基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后吧培养液稀释PEG,消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释,分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例:骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等,常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间:在两种细胞的混合细胞悬液中,第1min滴加4.5ml培养液;间隔2min滴加5ml培养液,尔后加培养液50ml。③培养液的成分:对融合细胞,良好的培养液尤其重要,其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低,应随时核查培养基情况。
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