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[生物制品] 单克隆抗体技术简介

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发表于 2013-10-16 09:16:42 | 显示全部楼层 |阅读模式

抗原提纯与动物免疫

对抗原的要求是纯度越高越好,尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原,可取1×107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化,如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原,可将抗原所在的电泳条带切下,研磨后直接用以动物免疫。

选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠,鼠龄在8~12周,雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡,可同时免疫3~4只小鼠。

免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同,因动物、抗原形式、免疫途径不同而异,以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2~3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高,融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大,而且单克隆抗体的质量(如抗体的浓度和亲和力)也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3~4天,分离脾细胞融合。


骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备

选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞,各种骨髓瘤细胞株均可应用,但应用最多的是Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳,此外,该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×105/ml,倍增时间通常为10~15h。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性应大于95%)。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养,在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml,次日一般即为对数生长期细胞。

在体外培养条件下,细胞的生长依赖适当的细胞密度,因而,在培养融合细胞或细胞克隆化培养时,还需加入其他饲养细胞(feedercell)。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞,制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔,轻揉腹部数次,吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞,其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。

在制备饲养细胞时,切忌针头刺破动物的消化器官,否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至1×105/ml,提前一天或当天置板孔中培养。


细胞融合

细胞融合是杂交瘤技术的中心环节,基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后吧培养液稀释PEG,消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释,分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例:骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等,常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间:在两种细胞的混合细胞悬液中,第1min滴加4.5ml培养液;间隔2min滴加5ml培养液,尔后加培养液50ml。③培养液的成分:对融合细胞,良好的培养液尤其重要,其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低,应随时核查培养基情况。


 楼主| 发表于 2013-10-16 09:17:36 | 显示全部楼层
单克隆抗体的制备和冻存

筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备,因为融合细胞随培养时间延长,发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法,即将杂交瘤细胞在体外培养,在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备,一般应用无血清培养基,以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠,先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射,一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生,每只小鼠可收集5~10ml的腹水,有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高,每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外,腹水中的杂蛋白也较少,便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当,一般为5×105/鼠,可根据腹水生长情况适当增减。

选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好,冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低,而冻存在-70℃冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种,冻存过程中需格外小心。二甲亚砜(DMSO)是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在50%~95%之间。如果低于50%,则说明冻存复苏过程有问题。


单克隆抗体的纯化

单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化,腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高,纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的,也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法,多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体(最常用Sepharose)交联,制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱,回收率可达90%以上。蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合,同时还结合少量的IgM。洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测,小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时,1.44(吸光单位)相当于1mg/ml。经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。

单克隆抗体的大规模制备

(一)杂交瘤细胞的大量繁殖

克隆化的细胞可以在体外进行大量培养,收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限,其不能超过特定的细胞浓度,且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠(无胸腺的裸鼠),杂交瘤细胞就开始无限地繁殖,直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体,这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1 000倍。

利用免疫抑制剂,如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等,可以加速和促进肿瘤的生长。

1.材料

(1)经高压灭菌的降植烷。

(2)Balb/c鼠:5~8周龄。

(3)杂交瘤细胞:取对数生长期的细胞。

(4)RPMI—1640培养液

(5)新生牛血清

2.操作方法

(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷,注射后1~9周内种植细胞。

(2) 收取对数生长期的杂交瘤细胞,用5%FCS—1640液洗涤一次,1 000r/min离心10min。

(3) 取样,用台盼兰染色,计活细胞数,重新用5%FCS—1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液。

(4) 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞,每只腹腔注射1ml(含1.0×107个细胞/ml)。

(5) 接种后10天左右时间肿瘤体积最大,此时可由腹腔抽取腹水,每隔1~3天取1次,可取10次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。

(二)单克隆抗体的提纯

1.材料

(1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

20 mMol/L NaCl

(2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

40mMol/L NaCl

(3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

80 mMol/L NaCl

(4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

(5) 饱和硫酸铵液

(6) DEAE—纤维素柱

2.操作方法

(1)小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后,于1.00×105转离心30min,去沉淀。

(2)在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液,边加边搅拌,使溶液最终为50%硫酸铵浓度。

(3)此溶液置冰中30min~60min,然后5 000r/min离心10min,去上清。

(4)将沉淀溶于Tris-HCl缓冲液(40mMol/L NaCl)中(溶液可能混浊)。

(5)装入透析袋于Tris-HCl缓冲液(20 mMol/L NaCl)中透析除盐。

(6)离心去沉淀。

(7)溶液稀释(1:100或更高倍稀释)后,于280nm测蛋白含量,估计蛋白质含量

1A 280unit=0.8mg蛋白质

一般每ml腹水中,含有总蛋白约25mg~36mg。

(8)过DEAE—纤维素柱:纤维素柱高40cm,以20mMol/L NaCl Tris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。

样品进入柱床速度为1ml~2ml/min,以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脱,也有极少例外的单克隆抗体于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脱。

测OD280nm收集蛋白峰,单克隆IgG保存备用。

杂交瘤产生各种免疫球蛋白,但主要是IgG和IgM,究竟是哪种为主,则决定于抗原的免疫程序。免疫一次,且3天后就取脾,多为产生IgM的B淋巴细胞。免疫多次的多为IgG。

(三)单克隆抗体的鉴定

1.杂交瘤细胞染色体的检查 采用秋水仙素裂解法进行。

2.单克隆抗体的类型、亚型的测定:购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清,采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。

3.单抗的特异性鉴定 可以采用各种方法,如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等,同时还需做免疫阻断试验等。

4.单抗的效价测定 可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应,腹水效价可达5×104。而采用ELISA检查,腹水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。

5.必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。

杂交瘤细胞的保存

(一)保存

当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后,必须将一部分杂交瘤细胞保存,否则在连续传代的过程中,可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中,难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下:

1.材料

(1) 细胞:取对数生长期的细胞。

(2) 10%二甲基亚砜保护液(二甲基亚砜能损坏滤器,而又被高压所破坏,所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品,无菌):含10%二甲基亚砜、20%灭活胎牛血清,70%RPMI—1640液。

(3) 20%FCS—1640培养液:含青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml。

(3) 20%FCS—1640培养液:含青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml。

2.操作方法

(1) 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液,加入10%FCS—1640液,使细胞悬浮。

(2) 1 000r/min离心10min,去上清。细胞沉淀用10%二甲基亚砜保护液制成悬液,使成1.0×107细胞/ml。

(3) 取样,台盼兰染色,计数活细胞,应在95%以上。(3) 取样,台盼兰染色,计数活细胞,应在95%以上。

(4) 用注射器将细胞分装安瓶,每瓶0.5ml~1.0ml,熔封安瓶。

(5) 放4℃ 2h。

(6) 放液氮罐气态部分(-70℃)15h。

(7) 转入液氮部分。

(二)复苏

1.从液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。

2.无菌操作打开安瓶,取出细胞悬液,转入组织培养瓶。

3.逐滴缓慢加入20%FCS-1640培养液3.5ml,这个过程延续3min。

4.5%CO2饱和湿度,37℃培养。

5.4h后弃去培养液上清,加入新鲜的20%FCS-1640培养液。

6.继续培养,换液,以至形成单层。

单克隆抗体的标记

目前动物用单抗,在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用,大多以诊断试剂(盒)的形式提供,其中核心试剂为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。

一、酶标记

1、辣根过氧化物酶(HRP)标记

辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基,加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合,形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合,在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了,用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。

程序一:

(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液,混匀,盖紧瓶塞,室温避光作用2小时。

(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。

(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水,或纯化单抗等(15mg/ml),混匀。

(4)称取Sephadex G25干粉0.3g,加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧,室温作用(避光)3小时或4℃过夜。

(5)用少许PBS将交联物全部洗出,收集洗出液,加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液,混匀,室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液,混匀,室温作用1小时(或4℃过夜)。

(6)将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化,分管收集第一峰。

(7)酶结合物质量鉴定:

克分子比值测定

酶量(mg/ml)=OD403×0.4

IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62

克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量,一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体,标记率一般为0.3-0.6,即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上,标记率可大于0.6,0.8,0.9;OD403/OD280等于0.4时,E/P约为1。

标记率=OD403/OD280

酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性,抗体活性及效价、特异性。

(8)HRP抗体结合物的保存:加入等量甘油后,小量分装-20℃存放,防止反复冻融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚防腐,否则会影响酶活性。必要时冻干保存,以BSA或脱脂牛奶作保护剂。

程序二:

(1)将5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中,加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml,室温搅拌作用1小时,以封闭HRP分子上的α和ε氨基。

(2)再加1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液,在室温中避光轻搅30分钟,溶液呈黄绿色;随后加1ml 0.06mol/L 乙二醇,轻搅1小时,中止氧化反应。

(3)移入透析袋中,在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液中,4℃透析过夜,更换三次缓冲液,注意避光。

(4)吸取上述醛化好的HRP溶液3ml,加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml,室温轻搅2-3小时,避光;加入5mg NaBH4 ,4℃放置3小时或过夜,或换用乙醇胺(2mol/L PH9.5)0.2ml,作用7小时。

(5)再移入透析袋中,在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小时,更换三次缓冲液。

(6)用3000r/min离心30分钟,除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次,沉淀用少许PBS溶解,透析或层析除盐,必要时进一步层析纯化。

(7)、(8)步骤同程序一。

2、碱性磷酸酶(AP)标记

碱性磷酸酶(AP)用于标记抗体,常用戊二醛一步法,将酶和单抗混合,再加入适量戊二醛,使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合,制备成结合物。该法简便,但所得产物不均一,抗体活性损失大,酶标记率低。其程序如下:

(1)将5mg AP加入1ml抗体溶液(2mg/ml)中溶解,装入透析袋,于4℃对0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小时,换液三次。

(2)加入2.5%戊二醛20ul,室温作用1-2小时,4℃对PBS透析过夜,其间换液三次。

(3)换用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液透析,4℃过夜,换液三次。

(4)取出标记抗体,用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml,即为AP标记物原液。

(5)每毫升中加入0.4ml甘油,小量分装,保存备用。

3、PAP、APAAP的制备

PAP(过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术)、APAAP(碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术)的制备对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔PAP、APAAP试剂供应,只要配以相应的桥抗体,即可非常便利地应用单抗。因为PAP法和APAAP法不用任何化学交联剂处理酶和抗体,它们的活性均不受化学因素的影响,提高了敏感性和特异性。PAP和APAAP试剂的制备方法常采用先将HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物,再加入酶盐水,过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应,调PH至2.3,随后立即中和,除去不溶解的沉淀物后,加入半饱和硫酸铵,纯化PAP或APAAP。

根据需要还可将PAP和APAAP试剂先与相应桥抗体结合后,再与特定单抗组成完整的诊断试剂,这样,单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。

鼠源单克隆抗体人源化进展

应用单克隆抗体技术抗肿瘤的导向治疗是恶性肿瘤的生物治疗方法之一。本文先介绍了单克隆抗体的特点和构型及研究现状,而后从非结合型单抗、单克隆抗体偶联物(包括化学免疫偶联物、放射免疫偶联物、免疫毒素、抗体导向酶-前体药物疗法)和其它(抗体-细胞因子融合蛋白、微型双特异性抗体)等几方面分别介绍了抗肿瘤导向治疗研究进展,并对未来提出了展望和指出了今后的研究方向。

自从1975年Kohler和Milstein发明了杂交瘤单克隆抗体(单抗)技术以来,单克隆抗体成为导向治疗最常用的载体,以单克隆抗体为载体的导向治疗的报道很多。特别是旨在高特异地杀伤癌细胞的肿瘤的导向治疗研究取得了极大的进展,临床及临床前期试验显示:针对肿瘤抗原设计的单抗具有较好的治疗效果,有望成为继化疗、放疗、骨髓移植等治疗手段后的又一新的治疗方法。本文就单克隆抗体技术导向治疗肿瘤的各种方法作简要介绍:

一、单抗的特点、构型及研究现状

理想的单抗应能特异性结合肿瘤抗原且与正常细胞的交叉反应低,设计时应使其对于不同的肿瘤细胞具有构型、相对分子质量大小的适配性以及杀伤力,可根据需要引入具有特定效应的功能结构域,以确保能将毒性负载特异性地导向肿瘤细胞,同时其抗原性宜低,不引起人体产生相应抗体,以免被快速清除,影响疗效。

基因工程提供了一些方法可以改善单抗的特性

1、通过产生“嵌合型”或“人源化”单抗从而减少“人抗鼠”反应

2、增强效应器官功能

3、改变血浆药物动力学和整个机体清除率

4、增强进入肿瘤组织的能力

5、增强亲和力

6、开发更多的可以有效释放的药物、毒素和生物反应改变剂。为最大限度降低单抗的抗原性,人们设计了“嵌合型”或称“人源化”单抗,即将小鼠型抗体中与抗原结合的部分与人类抗体的支架结合,形成可与相应抗原结合,又不引起免疫排斥反应的“嵌合型”单抗。

目前基因工程抗体研究较多的是小分子抗体,尤其是单链抗体(single chain v fragment scFv)。scFv是将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过肽链相连而获得的重组蛋白,scFv具有分子量小,约相当于完整抗体的1/6;组织穿透能力强,易于进入靶部位,适合靶向治疗;基因结构简单,构建表达方便;免疫源性比相应鼠源单抗小;可以制备融合蛋白;无Fc段,减少非特异性吸附;亲和力高等优点。

90年代以来出现了噬菌体抗体库技术,使人们从利用DNA重组技术改造原有抗体,发展到了用基因工程技术克隆新的抗体,噬菌体抗体库筛选能力强,可获得高亲合力、高稳定性、低免疫原性抗体[6]。90年代以来出现了噬菌体抗体库技术,使人们从利用DNA重组技术改造原有抗体,发展到了用基因工程技术克隆新的抗体,噬菌体抗体库筛选能力强,可获得高亲合力、高稳定性、低免疫原性抗体[6]。

二、非结合型单抗

治疗肿瘤用非结合型单抗依靠单抗诱导的免疫效应或单抗的直接效应杀死肿瘤细胞。单独用单抗的主要优点它们的毒副作用小、相关产物安全。

其抗肿瘤作用主要通过

1、与相应抗原结合引起ADCC效应或CDC,使肿瘤细胞死亡

2、促发细胞内信号系统的改变,促进细胞凋亡

3、抑制肿瘤细胞增殖,促进其分化。非结合型单抗CD2 0 (Rituximab)是治疗淋巴瘤的一种特异性单抗,该药在美国已于1 997年秋被FDA批准,是第一个抗肿瘤单抗,主要适用于复发或化疗耐药性的B细胞型的非霍奇金淋巴瘤。由罗氏制药公司生产的美罗华(Rituximab)对CD20阳性的B细胞淋巴瘤有肯定的疗效,尤对初治或复发的低度恶性或滤泡型淋巴瘤疗效显著而不良反应轻微。对CD20阳性的其他NHL亦可能取得较好疗效,且其全身毒性轻,是一个有前途的抗肿瘤新药。美罗华与化疗联合应用可进一步提高疗效[4]。

三、单克隆抗体偶联物

1、化学免疫偶联物

单抗药物具有更高的疗效, 通过药物分子上特殊的功能集团如羟基、巯基、氨基将化疗药物与单抗相连接而组成化学免疫偶联物的其目的是提高药物的靶向性。

有以下优点

(1)利用载体的靶向以及提高肿瘤部位的有效药物浓度,提高了药物疗效

(2)少了药物剂量

(3)降低毒副作用。由抗人体肿瘤的单抗与药物构成的化学偶联物对移植于裸鼠的相应人体肿瘤生长有抑制作用。曾与单抗进行偶联并在裸鼠进行疗效观察的抗癌药物有阿霉素、柔红霉素、平阳霉素、博安霉素、丝裂霉素、新制癌菌素、氨甲蝶呤、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、顺铂以及长春碱类衍生物等。使用的肿瘤模型包括肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳癌、卵巢癌、脑胶质瘤、黑色素瘤、淋巴瘤和白血病等。Mylotarg是由抗CD33分子的单抗和抗肿瘤抗生素calicheamicin连接的偶联物,在抗肿瘤单抗药物中,是第1个于2000年获批准上市的药物与单抗偶联物de Vetten[12]等用抗CD33-Calicheamicin偶合剂(gemtuzumab ozogamicin, CMA-676)治疗1例Ph’染色体阳性AML,用CMA-676单独用药2次,即获细胞形态学和细胞遗传学水平的CR,用实时PCR的方法检查,发现该制剂可杀灭骨髓内3个log的肿瘤细胞。。

2、放射免疫偶联物

将放射性核素连接在单抗上称为放射免疫偶联物是一个在肿瘤细胞检测和相比只用非结合型单抗而增强细胞杀灭效应的广泛研究策略。这个方法的优点在于通过“串扰”(crossfire)效应能杀死包括邻近抗原阴性细胞。如果放射性核素与抗原抗体复合物一同被细胞“内在化” ,则会很快被清除。因此在设计放射性物质结合型单抗时,人们常选择不会被“内在化”的靶抗原,如抗原CD2 0,或选择不会被“内在化”的核素,如90y。有关放射性物质结合型单抗的临床研究主要集中于淋巴瘤和AML。

脾细胞和骨髓瘤细胞的融合

1、脾细胞和骨髓瘤细胞一般按2:1-5:1的密度混合,有的报道可以到10:1,不过总体来说我们常选3:1-5:1,记住,原则是脾细胞的数量比骨髓瘤的多。

2、融合前,一般用HAT培养基做饲养细胞铺板,这是融合前的准备工作,因为饲养细胞分泌的某些细胞因子有助与融合的杂交瘤细胞生长,并且提供一定的细胞密度。通常是可以融合前一天做饲养细胞,老鼠选ICR或是BALB/C与ICR杂交的鼠,一只老鼠可以铺2-3块96孔板。

3、我们融合选用96孔细胞培养板。融合时将脾细胞与骨髓瘤混合后离心,然后用手掌稍稍搓离心管,将离心压紧的细胞松散开,再加融合剂PEG,在45秒内加完1毫升的PEG,之后静置30-60秒,这个时间时给PEG作用使细胞膜融合的,此时将离心管握在手中,利用自己的体温给细胞一个比较温暖的环境。之后加30-40毫升DMEM终止(1640也行,只要用不完全培养基即可),一般前30-45秒速度慢一些,中间30秒可以一滴滴的加,最后30-60秒就快速加。终止后静置在37度水浴约10分钟,然后离心,用HAT重悬,分装96孔板即可。

4、融合后3-4天补加HAT培养基(2-3滴),融合后7-8天则开始给细胞换液,用HT培养基培养,根据你的细胞具体情况看,可以换1-2次液。一般细胞如果状态好的话,9-11天就可以生长起来了,后面检测细胞时HT培养细胞。
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发表于 2013-10-17 10:12:47 | 显示全部楼层
好好学习天天向上

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对哦,共同进步  详情 回复 发表于 2013-10-18 09:47
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 楼主| 发表于 2013-10-18 09:47:02 | 显示全部楼层
yangzi 发表于 2013-10-17 10:12
好好学习天天向上

对哦,共同进步
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发表于 2020-3-6 17:17:30 | 显示全部楼层
谢谢老师分享
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