细菌内毒素检查法常见问题与探讨（二）

九頭鳥

在“细菌内毒素检查法常见问题与探讨（一）”中，对细菌内毒素检查前应做准备工作中的样品检查、标准核对及试验用仪器检查进行了讨论，本文继续对细菌内毒素检查前应做准备工作中的除热原器械的准备、试验用试剂的检查进行讨论。

一、除热原器械的准备
在细菌内毒素检查试验中，除了使用经验证的一次性除热原器械外，为节约成本，常常需要使用一些可以重复利用的器械：如玻璃试管、秤量用烧杯、移液管及不锈钢秤量勺等。重复利用器械的制作材料必须要耐清洗，耐250℃高温，且不干扰试验。重复使用的器械，必须对其进行除热原处理。除热原处理的主要步骤有：
1、实验器皿首先要进行清洁处理，除去可能黏附的凝胶蛋白等。
2、将初步清洗后的器皿放入专用洗液中浸泡：如三效热原灭活剂等。
3、用自来水反复冲洗干净后，再用蒸馏水或纯净水冲洗。
4、 250℃30分钟或其他适宜的方法（须经验证）干烤除热原。
在处理过程中容易产生以下主要问题：
1、未除去可能黏附的凝胶蛋白等，经干烤后，器械发黑，有碳化物附着。
2、清洗不干净，有洗涤剂残留，残留洗涤剂干扰实验，从而影响到实验结果的准确性。
3、 干烤时间不够，未注意升温时间。
4、玻璃试验反应管用小刷子刷，造成管内壁不光滑。

二、试验试剂的检查
如果不考虑为排除干扰所使用的各种试剂，细菌内毒素检查所使用的试剂只有鲎试剂、细菌内毒素检查用水和内毒素工作标准品3种。
鲎试剂是细菌内毒素检查法的基本试剂，没有鲎试剂就没有细菌内毒素检查法。如果鲎试剂存在问题，那么试验结果的准确性就无从谈起。
鲎试剂是用美洲鲎或东方鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成，是不同的酶和辅助因子的混合物。虽然每个鲎试剂生产厂家的提取和生产过程相类似，但他们又各自有自己的配方来制备不同灵敏度的试剂，如添加缓冲液、活性剂等等。对于鲎试剂，试验中容易存在的问题主要有：

1、对鲎试剂的一些表达概念不清：如规格、灵敏度等。
规格是指装量规格，也就是为使鲎试剂复溶，每支鲎试剂中须加入的细菌内毒素检查用水（或复溶液）的量，以ml/支表示。
鲎试剂的标示灵敏度是指在规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度，用EU/ml表示。目前市场上主要有以下几种：1EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml及0.03EU/ml。

2、 对细菌内毒素检查法限值的定义理解不清，不知该怎样选择使用鲎试剂。
细菌内毒素检查法中对内毒素限值的定义是每小时供试品溶液静脉注入人体内，不引起热原反应的最大内毒素剂量（阈值），以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示。通常，根据供试品的限值要求及其对试验的干扰情况，选择使用不同灵敏度的鲎试剂，在不存在干扰的情况下，选择低灵敏度鲎试剂更经济，操作更简便。使用多装量鲎试剂可节约成本、提高试验结果的平行性，缺点是操作麻烦。有些人简单的认为限值为0.25EU/ml，就必须使用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂，而对于限值为0.01EU/mg的供试品，感到无从下手。

3、鲎试剂、内毒素工作标准品及细菌内毒素检查用水的配套问题。由于不同厂家生产的鲎试剂的配方不同，其缓冲作用、二价阳离子水平也都有所不同，所用的鲎试剂复溶液成分也就有可能不同，有的厂家还把增感剂、二价阳离子加到复溶液中。鲎试剂在出厂时，各厂均经过匹配实验进行验证，并根据验证结果标示灵敏度，所以要使用同一厂家配套的试剂、水和内毒素工作标准品。如果经灵敏度复核且实验结果符合要求，也可采用不匹配的水和内毒素工作标准品，但使用时，一定要配套使用灵敏度复核时的试剂、水和内毒素工作标准品。

4、 鲎试剂灵敏度复核试验
《中国药典》2005年版明确规定：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
可能影响检验结果的改变包括：配套试剂、试验器械及其清洗方法、恒温方法、实验室环境条件、试验人员等等的改变。通过鲎试剂的灵敏度复核实验，我们可以验证实验环境、实验材料、器具和设备及实验人员的实验技能等是否符合做细菌内毒素检查实验的要求。